Postmortale diagnose van hondsdolheid bij dieren door de bijgewerkte, gemultiplexte LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactietest

Hondsdolheid is honderd procent dodelijk en een snelle, nauwkeurige diagnose is nodig om levensreddende behandeling te krijgen bij degenen die het het hardst nodig hebben. Betrouwbare laboratoriumtests zijn echt cruciaal voor de bestrijding van hondsdolheid. De CDC heeft een stapsgewijs protocol ontwikkeld voor rabiëstesten met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase PCR of RT-PCR, met behulp van een gevalideerde realtime Alisa-virustest genaamd LN34, waarmee laboratoria de diagnostische nauwkeurigheid kunnen verbeteren en de preventie van rabiës kunnen ondersteunen.

Decennialang was hondsdolheidstesten afhankelijk van directe fluorescentie-antistoftesten, DFA of FAT genoemd. Veel internationale laboratoria gebruiken echter ook RT-PCR voor hondsdolheidstesten vanwege de uitstekende gevoeligheid en nauwkeurigheid. De DFA-test voor rabiës vereist gespecialiseerde microscopen, koelketenopslag, gespecialiseerde training van personeel en reagentia hebben de afgelopen jaren tekorten ervaren; PCR en RT-PCR worden nu veel gebruikt voor pathogenentests.

Veel laboratoria beschikken al over PCR- en RT-PCR-apparatuur en expertise, en de benodigde reagentia zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers. Kosten vormen een grote belemmering voor rabiëstesten in gebieden met de meeste menselijke rabiësgevallen. De CDC ontwikkelde een multiplexvorm van de LN34-assay, die de kwaliteitscontrole verbetert en de kosten per getest monster verlaagt.

RT-PCR wordt steeds vaker toegepast voor rabiësdiagnostiek omdat het veel wordt gebruikt voor het testen van andere ziekteverwekkers en de resultaten gemakkelijk te interpreteren zijn. Maar het gebruik van een gevalideerde test is uiterst belangrijk, en het is even belangrijk om zeker te weten dat de test presteert zoals verwacht. Ons stapsgewijze protocol omvat kwaliteitscontroles, veiligheidsoverwegingen en best practices voor PCR om laboratoria te helpen op weg te komen.

Begin met het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een veiligheidsbril, een gesloten voorjas en twee paar handschoenen. Maak het werkoppervlak schoon en desinfecteer met een kwartaire ammoniumverbinding of een ander geschikt desinfectiemiddel om het rabiësvirus te inactiveren. Leg een met plastic bekleed absorberend kussentje op het werkblad neer, waarbij je met een schoon eenmalig scalpel weefsel verzamelt dat een volledige doorsnede van de hersenstam en het cerebellum vertegenwoordigt.

Voor homogenisatie en RNA-extractie maal je uiteindelijk de benodigde weefsels met een eenmalige scalpel. Smeer het gehaktweefsel uit met een wattenstaafje en breng het wattenstaafje over in een buisje dat vooraf gevuld is met homogenisatiebuffer en kralen. Na het verwijderen van de buitenste handschoen met QAC-ontsmettingsmiddel verdund 1:256, maak je het werkstation, de apparatuur en de buitenkant van de monsterbuizen schoon en desinfecteer je.

Homogeniseer monsters met een mini-kraalklopper gedurende 60 seconden. En inspecteer de buizen visueel. Laat de monsters vijf minuten op kamertemperatuur staan.

Maak ten slotte het werkstation, de apparatuur en de buitenkant van de monsterbuisjes schoon en desinfecteer met QAC-desinfectiemiddel voordat je doorgaat met RNA-extractie. Om te beginnen voert u oppervlaktedecontaminatie uit van de biologische veiligheidskast met QAC verdund tot 1:256. Voer extra reiniging uit om stof of andere milieuverontreinigingen te verwijderen.

Leg een met plastic beklede absorberende werkmatte op het werkplatform. Vervolgens organiseer je de reagentia en de monsters in de bioveiligheidskast. Leg alle verzamelbuizen in een schoon rek voor microcentrifugebuizen.

Vul een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter vooraf met 300 microliter 100% ethanol per hersenmonster. Centrifugeer de gehomogeniseerde sheet-hersenmonsters op 10.000 tot 16.000 G gedurende twee minuten in een tabletop microcentrifuge. Breng het heldere roze supernatant over in een nieuw steriel buisje met 100% ethanol, pipetet omhoog en omlaag om te mengen en 600 microliter van het ethanolsupernatantmengsel over te brengen naar een spinkolom in een verzamelbuis.

Centrifugeer één minuut totdat de vloeistof door de kolom stroomt, gooi de stroom weg en breng elke kolom over in een nieuwe verzamelbuis. Voeg 400 microliter RNA pre-wash buffer toe aan elke kolom. Centrifugeer het mengsel op 10.000 tot 16.000 G gedurende 30 seconden en voer de stroom erdoorheen.

Zet elke kolom terug in dezelfde opvangbuis en herhaal de voorwasstap nog een keer. Voeg vervolgens 700 microliter RNA-wasbuffer toe aan elke kolom. Centrifugeer op 10.000 tot 16.000 G gedurende twee minuten.

En breng ze voorzichtig over in een RNase-vrije buis. Verwijder de doorstroombuis en de opvangbuis, verwijder en verwijder dan de buitenste handschoenen. Voeg nu 50 microliter DNase en RNase-vrij water direct toe aan de kolommatrix en incubeer 30 seconden.

Centrifugeer dan op 10.000 tot 16.000 G gedurende één minuut. Breng RNA zorgvuldig over naar een nieuwe schroefbovenkant, plat-onder-aansteker, gelabelde microcentrifugebuis voor RT-PCR-assay. Om te beginnen ontdooi je één stap RT-PCR-buffer, geen template-controle, nucleasevrij water, primers en probes op ijs, in de master mix-voorbereidingsruimte.

Leg één stap RT-PCR-enzym op ijs. Bereken het volume van elk reagens voor de LN34 gemultiplexeerde en beta A Master Mixes. Wijs putten aan voor elk monster in drievoud voor de LN34 multiplexed assay met behulp van een 96-put plaatkaart.

Na vortexen en draaien doseren 23 microliter LN34 multiplex Master Mix in elke toegewezen LN34-bron. Om negatieve template control reactions op te zetten, voeg je twee microliter PCR-kwaliteit water toe aan elke negatieve template control well. Zet de 96-putplaat op ijs.

Maak het werkstation schoon met 70% ethanol. Nu in de template edition workspace, ontdooi RNA-monsters en positieve controle single use aliquot van kunstmatig RNA op ijs. Na vortexen centrifugeren ze kort buisjes met RNA-monsters en pipetteer twee microliter monster of positief controle-RNA in de overeenkomstige put.

Na het toevoegen van alle monsters plaats je de optische lijmdeksel over de putten om ze volledig af te sluiten. Centrifugeer de plaat op 500 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur, plaats de afgesloten plaat in een realtime of kwantitatieve PCR-instrument dat gekalibreerd is voor FIC en VIC Hex reporter maten. Stel het instrument in op de juiste cyclusparameters.

Na afloop van de run stel je de drempelwaarden in op 0,2 voor LN34 en 0,05 voor bèta-actine. Controleer de controle-samplecurves op kwaliteitsproblemen. De LN34-test toonde succesvolle amplificatiecurves met positieve resultaten die de drempel overschreden bij verschillende cyclusdrempelwaarden wanneer deze op een logaritmische schaal werd bekeken.

En sigmoid-amplificatiecurves op lineaire schaal voor zowel LN34 als bèta-actine. Negatieve resultaten vertoonden vlakke lijnen zonder versterking. Abnormale amplificatiecurves werden geïdentificeerd, waarbij sommige lineaire in plaats van sigmoïdale toename van fluorescentie vertoonden, wat atypische resultaten aangeeft.

De overeenkomstige multicomponentgrafieken toonden onregelmatige golvende fluorescentiesignalen in plaats van verwachte gladde krommen. Het benadrukt de noodzaak om amplificatieplots te analyseren in plaats van uitsluitend te vertrouwen op cyclusdrempelwaarden.