Name: Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer hoe u tumorweefselmonsters van mensen en muizen snel dissocieert voor eencellige RNA-sequencing. Deze methode helpt onderzoekers de immuunrespons tegen tumoren te bestuderen en voorspellers van therapieresistentie te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Adelson Medical Research Foundation (AMRF), de Melanoma Research Alliance (MRA) en U54CA224068. Figuur 1, Figuur 4 en Figuur 5 zijn gemaakt met BioRender.com.

Deze studie voldeed aan alle institutionele richtlijnen met betrekking tot het bemonsteren van menselijk weefsel. Er werd geïnformeerde toestemming ontvangen van patiënten en identificeerbare voorbeeldgegevens werden geanonimiseerd. Monsters worden verzameld in de operatiekamer, in een oplossing van RPMI, zoutoplossing of PBS geplaatst en via de afdeling pathologie bevestigd als kanker voordat ze in onderzoek worden gebruikt. Alle stappen, behalve wanneer aangegeven, moeten worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs. Werk in een bioveiligheidskap bij het verwerken van menselijk weefsel. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Verkrijgen van de steekproef
<ol><li>Verkrijg een solide tumormonster in een buis met media en plaats het op ijs.<ol><li>Instrueer het personeel van de operatiekamer om het monster te vervoeren in een buis die voldoende RPMI, zoutoplossing of PBS bevat om het weefsel volledig onder te dompelen om uitdroging van het monster te voorkomen. OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster niet uitdroogt, omdat dit de levensvatbaarheid vermindert.</li>
	</ol></li>
	<li>Koel alle centrifuges af tot 4 °C en breng de thermische mixer naar 37 °C.</li>
	<li>Verwijder de bereide dissociatie-enzymen voor menselijke of muizentumoren (materiaaltabel), ontdooi ze op de thermische mixer van 37 °C en verplaats ze naar ijs zodra ze zijn ontdooid.</li>
	<li>Haal een aliquot van 20 ml RPMI op.</li>
	<li>Registreer relevante steekproefinformatie (bijv. patiënt-ID, de-identificatie, steekproeftype).</li>
	<li>Breng het monster over naar een weefselkweekschaal van 60 mm (geplaatst op ijs) door de buis meerdere keren om te keren en de inhoud in de schaal te gieten om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal wordt overgebracht. Als het monster bij aankomst niet in media is geleverd, voeg dan verse RPMI-media toe aan de schaal.<ol><li>Als het monster gefragmenteerd is, laat dan de buis met het monster 5 minuten draaien bij 450 × g, 4 °C, gooi het supernatant weg, resuspendeer het monster in 420 μl RPMI en ga naar sectie 2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mechanische en enzymatische vertering
<ol><li>Pipetteer 420 μl media uit het monsterschaaltje van 60 mm in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Probeer eventuele voorbeeldfragmenten die in de media zijn opgehangen op te nemen.</li>
	<li>Breng het monsterweefsel met een pincet over van de schaal van 60 mm naar het buisje van 1,5 ml met media. Knip het monster af met een schone schaar in de buis, zodat de stukjes maximaal 2-3 mm in diameter zijn.</li>
	<li>Voeg spijsverteringsenzymen, bereid volgens de specificaties van de fabrikant (materiaaltabel), toe aan het monster in de volgende volumes: 42 μl enzym H (niet-specifieke proteasen) voor menselijke monsters, enzym D (niet-specifieke proteasen) voor muizenmonsters, 21 μl enzym R (niet-specifieke proteasen) en 5 μl enzym A (nuclease).</li>
	<li>Voeg nog eens 420 μL media toe uit de schaal of tot de 1 ml-markering op de buis. Niet meer dan 420 μL media gebruiken.</li>
	<li>Draai de buis gedurende 5 s en plaats deze in een thermische mixer die verticaal op zijn kant staat (Figuur 1B). Incubeer bij 37 °C, 450 rpm, gedurende 15 min. OPMERKING: Verwijder tijdens de incubatie alle 10x Genomics-materialen die nodig zijn voor het genereren van GEM, aangezien deze 30 minuten nodig hebben om op kamertemperatuur te komen</li>
</ol>3. Filteren van monsters
<ol><li>Plaats een celfilter van 50 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml en vul het filter door er 1 ml verse RPMI-media doorheen in de buis te leiden.</li>
	<li>Breng het monster na de spijsvertering over in de buis van 15 ml met behulp van een brede pipetpunt van 1.000 μl met een lage retentie. Was de slang van 1.5 ml met 1 ml vers materiaal en breng het materiaal over naar het filter om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal door het filter wordt geleid.</li>
	<li>Pak een plastic spuit van 1 ml en haal alleen de zuiger eruit (gooi de rest van de spuit weg). Gebruik de achterkant van de zuiger van de spuit om het monster met een draaiende beweging op het filter te malen en te duwen.</li>
	<li>Was het filter met 5 ml media en eventuele resterende media van de schaal waarin het monster zich bevond (sectie 1) om eventuele cellen te verzamelen die mogelijk van het weefsel zijn losgekomen.</li>
	<li>Plaats een celfilter van 30 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml, vul het filter met 1 ml media en breng de inhoud van de buis met het gedissocieerde monster door het filter. OPMERKING: Met deze stap wordt groot vuil verwijderd dat verstopt kan raken of een bevochtigingsfout kan veroorzaken bij het uitvoeren van het monster met behulp van de 10x Genomics microfluïdische chips.</li>
</ol>4. Lysis van rode bloedcellen
<ol><li>Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig de media op en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.</li>
	<li>Resuspendeer in ACK Lysis-buffer om rode bloedcellen (RBC's) te verwijderen en registreer het gebruikte volume. Het volume is afhankelijk van de grootte van de pellet en de mate van RBC's in de pellet. OPMERKING: Geresuspendeerde ACK-monsteroplossing moet kleurloos zijn als er voldoende ACK Lysis-buffer is toegevoegd, omdat dit de rode bloedcellen uit het monster zal verwijderen.</li>
	<li>Centrifugeer de monsterbuisjes bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op.</li>
	<li>Herhaal stap 4.2-4.3 indien nodig totdat de monsterpellet na centrifugeren geen zichtbare rode kleur meer heeft (Figuur 2). Noteer eventuele extra volumes ACK Lysis-buffer die in deze stap worden gebruikt.</li>
	<li>Resuspendeer de monsterpellet in verse media ter voorbereiding op het tellen.</li>
</ol>5. Cellen tellen
<ol><li>Doe 10 μL trypan blauw in een buisje van 1,5 ml. Meng de gedissocieerde cellen voorzichtig, neem 10 μL monster en meng (1:1) met het trypanblauw. Laad 10 μL aan elke kant van een hemocytometer en tel de cellen.</li>
	<li>Registreer de celconcentratie, het totale aantal live cellen, het levensvatbaarheidspercentage en het uiteindelijke mediavolume na telling.</li>
	<li>Zorg ervoor dat het celgetal tussen 700 en 1.200 cellen/μl ligt (7 × 105- 1,2 × 106/ml) voor een optimale 10x Genomics-run.<ol><li>Als het monster te geconcentreerd is, verdun het dan met media en vertel het opnieuw.</li>
		<li>Als het monster te verdund is, centrifugeer het monster dan gedurende 5 minuten bij 450 × g 4 °C en resuspendeer het in een kleinere hoeveelheid media.</li>
		<li>Als de levensvatbaarheid van de cellen lager is dan 80%, voer dan een levend-dode procedure uit om dode cellen te verwijderen.</li>
		<li>Als er minder dan een miljoen cellen zijn, zie rubriek 6.</li>
		<li>Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid > 10%, zie rubriek 6.</li>
		<li>Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid < 10%, zie rubriek 7.</li>
		<li>Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar de bewerkte cellen op ijs en ga onmiddellijk verder met het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Verwijdering van dode cellen - Kit 1
OPMERKING: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de reagentia voor het verwijderen van dode cellen gebruikt, omdat deze gemakkelijk besmet kunnen raken.
<ol><li>Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Bereid isolatiemedia voor in een conische buis van 15 ml en bewaar deze op kamertemperatuur: 9,8 ml PBS, 10 μl CaCl2 en 200 μl warmte-geïnactiveerde FCS (toegevoegd in een bioveiligheidskap).</li>
	<li>Na het centrifugeren het medium uit de pellet opzuigen en resuspenderen in 1 ml van het isolatiemedium.</li>
	<li>Centrifugeer de tube opnieuw bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in 100 μl isolatiemedia.</li>
	<li>Breng 100 μL monster in isolatiemedia over in een putje van een PCR-stripbuis van 0,2 ml.</li>
	<li>Voeg in een bioveiligheidskap 10 μl Annexin V-cocktail en 10 μL Biotine Selection Cocktail toe aan het putje met 100 μl van het monster in isolatiemedia. Pipetteer de oplossing en laat deze 4 minuten op kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Draai na 4 minuten de dextran-gecoate magnetische deeltjes gedurende 30 s in een wervel. Voeg 20 μL van de korrels en 60 μL isolatiemedia toe aan het monster (een totaal volume van 200 μL). Als de levensvatbaarheid lager is dan 40%, schaal dan de hoeveelheid korrels op tot 40 μL terwijl u het volume van de isolatiemedia aanpast (tot 40 μL), waarbij u een totaal volume van 200 μL aanhoudt. Pipettemeng en laat de oplossing 3 minuten op kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Plaats de stripbuis op een 10x Genomics magnetische scheider (op de hoge stand) gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de vloeistof uit de stripbuis over zonder de korrels te verstoren in een nieuwe 1,5 ml lo-bind microcentrifugebuis. Verwijder de stripbuis niet van de magneet.</li>
	<li>Centrifugeer het buisje van 1,5 ml met het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid RPMI-media op basis van de cellen voor de grootte en het aantal pellets, zoals beschreven in sectie 5. Herhaal de procedure voor het verwijderen van dode cellen als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft (Figuur 3 en Figuur 4). OPMERKING: Resuspendeer geen cellen in isolatiemedia voor stroomafwaartse GEM-generatie, aangezien het calciumchloride het inkapselingsproces en de omgekeerde transcriptie (RT) stap zal verstoren.</li>
	<li>Bewaar bewerkte cellen op ijs als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80% en ga onmiddellijk over tot GEM-generatie volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>7. Verwijdering van dode cellen - Kit 2
NOTITIE: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de kitreagentia gebruikt.
<ol><li>Plaats de microbeads en de 20x Binding Buffer stock-oplossing in een bioveiligheidskap.</li>
	<li>Centrifugeer de monstersuspensie bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Bereid 1x bufferoplossing onder steriele omstandigheden met behulp van 1 ml van de 20x Binding Buffer stock-oplossing die wordt gepipetteerd in 19 ml DNAse-, RNAse-vrij gedestilleerd water.</li>
	<li>Zodra het centrifugeren is voltooid, zuigt u het supernatant op, voegt u de microbeads toe, mengt u het monster voorzichtig en incubeert u het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.<ol><li>Wanneer het celgetal 107 of minder is, voeg dan 100 μL van de microbeads toe.</li>
		<li>Voor tellingen hoger dan 107 totale cellen, pas de microbeads aan voor een eindconcentratie van 100 μL per 107 levende cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zorg tijdens de incubatie voor één MACS-positieve selectiekolom, MACS-multistand en de bijbehorende magnetische scheider. Zorg ervoor dat de separator waterpas staat op de multistand en dat er geen ander metaal of magnetisch voorwerp in de buurt van de standaard is, aangezien de magnetische kracht krachtig is en de efficiëntie van het verwijderen van dode cellen kan beïnvloeden. Plaats de kolom stevig in een scheidingshouder met de vleugels naar buiten gericht.</li>
	<li>Als het totale resuspensievolume na incubatie minder dan 500 μl is, voeg dan 1x bindingsbuffer toe tot het totale volume 500 μl is.</li>
	<li>Plaats een conische buis van 15 ml onder de kolom en vul de kolom met 3 ml 1x Binding Buffer.</li>
	<li>Vervang de conische buis door een nieuwe conische buis van 15 ml voor het verzamelen van celmonsters en voeg het monster toe aan de kolom, zodat het volledig door de kolom kan stromen.</li>
	<li>Was de kolom 4 x 3 ml 1x Binding Buffer en voeg slechts één wasbeurt per keer toe nadat de vorige wasbeurt volledig door de kolom is gestroomd.</li>
	<li>Centrifugeer na de vierde wasbeurt de conische buis met de geïsoleerde cellen gedurende 5 minuten bij 450 × g, 4 °C. Gooi de kolom en de resterende 1x Binding Buffer weg.</li>
	<li>Resuspendeer de monsteroplossing in de juiste hoeveelheid RPMI-media op basis van de korrelgrootte en tel de geïsoleerde cellen volgens de methode die is beschreven in sectie 5 (figuur 3 en figuur 5).<ol><li>Als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft en het totale aantal cellen 106 of minder is, herhaal dan rubriek 6.</li>
		<li>Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar dan de bewerkte cellen op het ijs en ga onmiddellijk over tot het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	</ol></li>
</ol>

Tumordissociatieprotocol voor analyse van single-cell RNA-sequencing

<ol><li>Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+cancer+immunotherapy%3A+Current+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects.</a> Front Immunol. 13, 961805(2022).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+in+cancer%3A+Applications%2C+advances%2C+and+emerging+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges.</a> Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+single-cell+RNA+sequencing+and+its+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research.</a> J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).</li>
<li>Ottaiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+chaos+to+opportunity%3A+decoding+cancer+heterogeneity+for+enhanced+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies.</a> Biology. 12 (9), 1183(2023).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Erfanian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+applications+in+single-cell+genomics+and+transcriptomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis.</a> Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+RNA+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Sade-Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+T+cell+states+associated+with+response+to+checkpoint+immunotherapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma.</a> Cell. 176 (1-2), 404(2019).</li>
<li>Pelka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+organized+multicellular+immune+hubs+in+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer.</a> Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).</li>
<li>Bill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL9%3ASPP1+macrophage+polarity+identifies+a+network+of+cellular+programs+that+control+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers.</a> Science. 381 (6657), 515-524 (2023).</li>
<li>Al'Khafaji, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+isoform+sequencing+using+programmed+cDNA+concatenation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+isolation+methods+on+the+human+transcriptome+profiling+and+microbial+transcripts+of+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood.</a> Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Fan, X. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cold+ischemic+time+and+freeze-thaw+cycles+on+RNA%2C+DNA+and+protein+quality+in+colorectal+cancer+tissues+biobanking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking.</a> J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).</li>
<li>LoCoco, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+approaches+to+extract+high-integrity+RNA+from+skin+and+other+pertinent+tissues+used+in+pain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research.</a> Pain Rep. 5 (2), e818(2020).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+tissue+dissection+to+isolate+viable+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells.</a> J Vis Exp. (195), (2023).</li>
<li>Janssen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+background+noise+and+its+removal+on+the+analysis+of+single-cell+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data.</a> Genome Biol. 24 (1), 140(2023).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single+cell+RNA-seq+artifacts%3A+A+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
<li>Sutermaster, B. A., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+high-yield%2C+high-throughput+cell+enrichment%3A+fluorescence+versus+magnetic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting.</a> Sci Rep. 9 (1), 227(2019).</li>
</ol>

M.S-F. ontving financiering van Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology, en was consultant voor Galvazine Therapeutics.

Dit protocol beschrijft de dissociatie van tumormonsters van mensen of muizen in een eencellige suspensie voor scRNA-sequencing met behulp van het 10x Genomics microfluïdische systeem. Bij het verwerken van weefsels die vaak afkomstig zijn van zeldzame vormen van kanker of die deel uitmaken van lopende klinische onderzoeken of lange experimenten voor muizentumoren, moet het monster tussen alle stappen optimaal en zorgvuldig worden bewaard. Alle stappen moeten snel worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C om de native cellulaire RNA-profielen te behouden en degradatie te voorkomen, aangezien langdurig werken bij kamertemperatuur de transcriptomische kwaliteit zal beïnvloeden 17,18.
Er moeten verschillende stappen worden ondernomen om ervoor te zorgen dat het verlies van cellen tijdens de procedure minimaal is, vooral bij het verwerken van biopsieën van kleinenaaldkernen 17. Ervoor zorgen dat alle fragmenten van het tumormonster in de spijsvertering worden opgenomen, zal leiden tot het meest succesvolle resultaat, aangezien meer cellen die uit het monster worden geëxtraheerd, de toekomstige 10x Genomics-inkapseling en sequencing zullen verbeteren en het totale aantal cellen en transcripten dat voor analyse wordt teruggewonnen. Als het monster vast komt te zitten in de buis waarin het aankomt, kunnen media worden toegevoegd, de buis worden omgekeerd en naar de schaal worden overgebracht voor verwerking. Als het eerste monster gefragmenteerd is of als de oplossing troebel is, wat wijst op de aanwezigheid van cellen in suspensie, zorg er dan voor dat het hele monster wordt verzameld voor enzymatische vertering door het monster te centrifugeren met de oplossing waarin het is aangekomen en het opnieuw te suspenderen in mediavolume voor vergisting (protocoldeel 1).
Zorg er bij het aanzuigen voor dat de pellet tijdens de procedure niet wordt gestoord. Laat bij het opzuigen extra volume over, dat met een P200-pipet kan worden verwijderd. Als de pellet wordt verstoord, kan het volume terug in de buis worden gedoseerd en opnieuw worden gecentrifugeerd. Na ACK-lysis of na levende dode verwijdering kan het monster in volumes van slechts 25 μl zijn. Het is dus van cruciaal belang om geen supernatans te verliezen dat de cellen bevat. Een goede mechanische vertering is essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen van belang worden blootgesteld aan enzymatische vergisting. Langere enzymatische vertering met behulp van de juiste enzymen en thermische mixer kan nodig zijn voor grotere steekproefgroottes 9,19,20. Hoewel specifieke enzymnamen gepatenteerd zijn, merkt de fabrikant enzym A op als een nuclease en enzymen H, D en R als niet-specifieke proteasen. Het is van vitaal belang om zoveel mogelijk van het tumormonster door het filter te laten gaan om de hoogst mogelijke celopbrengst te garanderen. Succesvol filteren zal ertoe leiden dat er geen of slechts een klein zichtbaar monster in het filter zit. Sommige stukken van het monster kunnen mogelijk niet worden gefilterd als het grote hoeveelheden vet- of bindweefsel bevat. Als er zichtbare stukjes van het monster op de bovenkant van het filter zitten, blijf dan de achterkant van de zuiger van de spuit gebruiken om het monster te malen en door te duwen met behulp van de draaiende beweging, terwijl u ook de bovenkant van het filter met meer media wast.
Het succes van de lysestap van rode bloedcellen wordt bepaald door het monster onder de microscoop te bekijken zodra het monster op de hemocytometer is geladen voor telling en levensvatbaarheid15,21. Als er voldoende ACK aan het monster wordt toegevoegd om rode bloedcellen te verwijderen, zouden er geen rode bloedcellen of zichtbare roodheid in de pellet zijn. Als er rode bloedcellen in het monster zichtbaar zijn, moet extra ACK worden toegevoegd en moet het monster opnieuw worden gecentrifugeerd bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Eenmaal gedaan, moet het supernatans worden opgezogen en kan de celkorrel opnieuw worden gesuspendeerd in RPMI-media voor visualisatie en telling.
Om een optimale 10x Genomics-run te garanderen, moet het celgetal tussen 700 en 1.200 cellen/μL liggen (7 × 10 5-1,2 × 106/ml). Een hoge concentratie verhoogt de doubletsnelheid (twee cellen in één druppel) tijdens druppelvorming. Als het aantal te hoog is, kan een geschikte hoeveelheid media aan het monster worden toegevoegd en opnieuw op een hemocytometer worden geladen voor hertelling. Als de concentratie te laag is, kan het monster opnieuw worden gecentrifugeerd bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten, waarbij het supernatans wordt opgezogen en opnieuw wordt gesuspendeerd in een lager volume media voordat het opnieuw wordt geteld. Het monster is klaar om te worden geladen voor 10x Genomics als de levensvatbaarheid van levende cellen hoger is dan 80% (Figuur 3).
Als de levensvatbaarheid van het monster lager is dan 80%, is een levend-dode procedure nodig voordat 10x Genomics16 wordt geladen. Als een ronde van levende dode verwijdering het levensvatbaarheidspercentage niet boven de 80% heeft gebracht, moet een andere ronde worden uitgevoerd als er in totaal meer dan 1 × 105 cellen zijn. Een hogere levensvatbaarheid voorkomt verstoppingen in het daaropvolgende 10x Genomics-protocol, verhoogt het celherstel en vermindert de aanwezigheid van omringend RNA. Het protocol van Kit 1 is geoptimaliseerd en geminiaturiseerd voor het snel dissociëren van kleinere weefselmonsters met een lager celaantal. Het verminderde volume van reagentia en de verkorte incubatietijden verhogen de celopbrengst en voorkomen een stressrespons-gensignatuur (FOS, JUN en JUNB) op verschillende cellen 9,22. Alternatieve methoden om levende cellen te verrijken zijn onder meer kleuring en sortering. Dit zou echter resulteren in een verminderde celopbrengst, langdurige incubatie van kleuring, wat de cellulaire toestanden zou kunnen beïnvloeden (bijv. aCD3e-antilichamen zullen T-cellen activeren) en stress veroorzaakt door de druk van de machine op de cellen tijdens het sorteren 9,22. Het voorbeeld in figuur 6 illustreert een UMAP die is gegenereerd na 10X Genomics Gene Expression (GEX)-sequencing en de conversie van de gegenereerde celbarcodes naar FASTQ-bestanden die vervolgens werden samengevoegd en uitgelijnd via CellRanger. Daaropvolgende sequentieresultaten en vergelijkingen van levend-dode-verwijdering werden uitgezet, waarbij celpopulaties in een monster voor en na verwijdering van levend-doden en verbeterde sequencingkwaliteit werden aangetoond. Het longmonster dat in figuur 6 wordt getoond, duidde op een probleem met de fractie van de metingen, aangezien deze minder dan 70% bedroeg. Deze waarschuwing werd gegenereerd vanwege een hoge omringende RNA in een populatie van gelyseerde of dode cellen. Na het verwijderen van dode cellen was deze fout echter niet meer aanwezig en resulteerde in een hoger percentage fracties in cellen23.
Single-cell RNA-sequencing is een kostbaar en precair proces dat het gebied van kankerimmunologie en kankeronderzoek drastisch heeft verbeterd. Het maakt verdere ondervraging mogelijk van genen, cellulaire toestanden en programma's die tot expressie komen en onderdrukt worden in specifieke celtypen, waardoor meer wordt onthuld over het gedrag en de heterogeniteit van kankers. Suboptimaal of weinig levensvatbaar weefsel genereert eerder gegevens van lage kwaliteit die artefacten kunnen creëren die de realiteit van de tumorbiologie wegnemen, wat het cruciale belang van een goede tumordissociatie en monstervoorbereiding benadrukt.

Hoewel veel vooruitgang in het kankeronderzoek heeft geleid tot de ontwikkeling en goedkeuring door de FDA van middelen die gericht zijn op remmende receptoren die tot expressie worden gebracht op immuun- en tumorcellen, bekend als checkpointblokkaderemmers, blijven therapieresistentie en het identificeren van mechanismen die de respons van de patiënt stimuleren, een uitdaging1. De complexe uitdaging om tumorheterogeniteit te karakteriseren op basis van zijn moleculaire diversiteit en het ingewikkelde samenspel tussen tumorcellen en de immuunmicro-omgeving vereist nieuwe benaderingen om dit complexe ecosysteem te ontleden met de resolutie van één cel. Het begrijpen van de moleculaire fijne kneepjes in tumoren en hun micro-omgevingen is cruciaal voor het bevorderen van therapeutische strategieën en het ontcijferen van de complexe biologie die ten grondslag ligt aan kankerprogressie2. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is steeds populairder geworden omdat het een analyse met hoge resolutie biedt van individuele cellen in complexe tumormonsters 3,4.
Tumorheterogeniteit, die genetische, epigenetische en fenotypische diversiteiten omvat, vormt een uitdaging bij het blootleggen van de fijne kneepjes van de kankerbiologie5. De conventionele methoden van bulk-RNA-sequencing hebben de neiging om de unieke expressieprofielen en fenotypes van heterogene celpopulaties die in tumoren aanwezig zijn, te verdoezelen, aangezien deze methoden signalen gemiddeld nemen over hele celpopulaties4. ScRNA-seq daarentegen maakt de dissectie van individuele celtypen mogelijk, waardoor diverse genexpressie, onderdrukkingspatronen en cellulaire toestanden worden onthuld die anders over het hoofd worden gezien 4,6. Het uitgangspunt van scRNA-seq ligt in het vermogen om de genetische en moleculaire handtekeningen van individuele cellen te decoderen, wat een enorme belofte inhoudt bij het ontdekken van nieuwe kankertherapieën7.
Door de genexpressieprofielen van tumorcellen en de omringende stromale en immuuncellen te ontcijferen, kunnen onderzoekers nieuwe therapeutische doelen identificeren en strategieën voor genetische precisiegeneeskunde ontwikkelen die zijn afgestemd op individuele patiënten. Bovendien biedt het ontleden van het immuunrepertoire binnen de micro-omgeving van de tumor cruciale inzichten in de wisselwerking tussen tumorcellen en immuuneffectoren, wat de weg vrijmaakt voor immunotherapeutische interventies3. Ondanks de vooruitgang in het gebruik van scRNAseq op klinische monsters, kunnen verschillende uitdagingen tijdens de verwerkingsstappen de RNA-integriteit, levensvatbaarheid en kwaliteit van de gegenereerde gegevens van de cel schaden. Bovendien kan het verwerken van weefsel met een lage cellevensvatbaarheid de omringende RNA-niveaus verhogen in de druppeltjes die worden gegenereerd tijdens de inkapseling van individuele cellen, wat resulteert in kruisbesmetting en onjuiste annotatie van celtypen, terwijl lange dissociatieprotocollen die bij 37 °C worden uitgevoerd, kunnen leiden tot de opregulatie van een stressrespons-gensignatuur in meerdere celtypen 8,9, 10. okt.
De stapsgewijze procedure (figuur 1A) die in dit protocol wordt beschreven, begint met snelle mechanische en enzymatische dissociatie van tumoren, gevolgd door filtratie en verwijdering van dode cellen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van elk tumormonster. Op dit moment is deze procedure geverifieerd in melanoom11, colorectaal12, hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom13, pancreas- en longtumormonsters (niet-gepubliceerde gegevens). Deze technieken zorgen voor het genereren van levensvatbare celsuspensies van hoge kwaliteit die cruciaal zijn voor downstream-analyses14. Met name het verwijderen van rode bloedcellen, verstoken van gesynthetiseerd RNA, wordt noodzakelijk om het monster te zuiveren15. Daaropvolgende evaluatie van het aantal cellen en de eliminatie van dode cellen dienen als voorwaarde voor een succesvolle 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM) generatie, barcodering, en verhogen het herstel van transcripten en gesequencede cellen zonder de uitsluiting van gevoelige populaties (bijv. neutrofielen en epitheelcellen) in gevaar te brengen16. Deze stappen zijn van fundamenteel belang bij het ontsluiten van het potentieel van analyse van eencellige resolutie in tumormonsters 9,10, het blootleggen van nieuwe genexpressieprofielen en immuunsignaturen die nodig zijn voor het stimuleren van innovatieve therapeutische interventies en het identificeren van nieuwe tumorkwetsbaarheden.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipet</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L low-retention pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L low-retention brede pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389212</td><td></td></tr><tr><td>10x Magnetic Separator</td><td>10x Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buizen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL zuigpipet</td><td>Corning</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L low-retention pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389226</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389225</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L low-retention pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389240</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389239</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropyleen conische buis</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm weefselkweekschaal</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-1</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL spuit</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>3090659</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>551660</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger&nbsp;</td><td>10x Genomics</td><td>N/A</td><td>https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest</td></tr><tr><td>Celtelling slides voor TC20 celteller</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 30&mu;m steriele wegwerpfilters</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50&mu;m steriele wegwerpfilters</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell removal Kit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C; kit 2</td></tr><tr><td>Dissectiepincet, fijne punt</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Microcentrifugebuizen, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17899</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C; Kit 1</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>5406000640</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000657</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Easypet 3 elektronische pipetcontroller</td><td>Eppendorf</td><td>EP4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384</td><td>Eppendorf</td><td>EP5384000012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C, gebruik in een biologische kap</td></tr><tr><td>Duitse roestvrijstalen schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-12</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dmi1 Microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>454793</td><td></td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Magnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>TempAssure 0.2 mL PCR 8-buisjesstrips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauwe kleurstof 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociatie Kit, Mens</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C, bereid enzymen volgens kitinstructies: Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym H flacon in 3 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.</td></tr><tr><td>Tumor Dissociatie Kit, Muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-730</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C, bereid enzymen volgens kitinstructies: Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym D flacon in 3 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.</td></tr><tr><td>UltraPure Gedestilleerde Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr></tbody></table>

dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige rna-sequencing

Dissociation of Human and Mouse Tumor Tissue Samples for Single-cell RNA Sequencing

Menselijke tumormonsters bevatten een overvloed aan informatie over hun micro-omgeving en immuunrepertoire. Effectieve dissociatie van menselijke weefselmonsters in levensvatbare celsuspensies is een vereiste input voor de single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pijplijn. In tegenstelling tot bulk-RNA-sequencingbenaderingen, stelt scRNAseq ons in staat om de transcriptionele heterogeniteit in tumormonsters op het niveau van één cel af te leiden. Het integreren van deze benadering in de afgelopen jaren heeft geleid tot veel ontdekkingen, zoals het identificeren van cellulaire immuun- en tumortoestanden en programma's die verband houden met klinische reacties op immunotherapieën en andere soorten behandelingen. Bovendien kunnen eencellige technologieën die worden toegepast op gedissocieerde weefsels worden gebruikt om toegankelijk chromatineregio's, T- en B-celreceptorrepertoire en de expressie van eiwitten te identificeren met behulp van DNA-antilichamen met streepjescodes (CITEseq).
De levensvatbaarheid en kwaliteit van het gedissocieerde monster zijn cruciale variabelen bij het gebruik van deze technologieën, aangezien deze de kruisbesmetting van afzonderlijke cellen met omringend RNA, de kwaliteit van de gegevens en de interpretatie dramatisch kunnen beïnvloeden. Bovendien kunnen lange dissociatieprotocollen leiden tot de eliminatie van gevoelige celpopulaties en de opregulatie van een gensignatuur voor stressrespons. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een snel universeel dissociatieprotocol bedacht, dat is gevalideerd op meerdere soorten tumoren bij mensen en muizen. Het proces begint met mechanische en enzymatische dissociatie, gevolgd door filtratie, rode bloedlysis en verrijking van levende doden, geschikt voor monsters met een lage input van cellen (bijv. biopsieën van naaldkernen). Dit protocol zorgt voor een schone en levensvatbare eencellige suspensie die van het grootste belang is voor het succesvol genereren van Gel Bead-In Emulsions (GEM's), barcodering en sequencing.

Een melanoombiopsie gesuspendeerd in RPMI werd verkregen en onmiddellijk op ijs geplaatst. Het monster werd overgebracht in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 420 μl RPMI en spijsverteringsenzymen, met een schaar in kleine stukjes gehakt en vervolgens gedurende 15 minuten enzymatisch verteerd in een verticaal geplaatste thermische mixer van 37 °C (figuur 1). Na de spijsvertering werd het monster gefilterd door een steriel wegwerpfilter van 50 μm en werd het filter gewassen met verse RPMI om de celopbrengst te verhogen (figuur 1). De resterende delen van het weefsel die na de wasbeurten overbleven, werden weggegooid, omdat dit ongewenste biologische materialen zijn (bijv. vetweefsel).
Op basis van de kleur van de resulterende celkorrel was 15 ml ACK-lysisbuffer nodig om de rode bloedcellen te verwijderen (Figuur 2). Na resuspensie in 3 ml RPMI-media bedroeg het totale celgetal 1 × 106/ml, met een levensvatbaarheid van <80% (figuur 3A). Dit gaf aan dat één cyclus van verrijking van levende cellen met behulp van Kit 1 (protocolsectie 6) nodig was voordat werd overgegaan tot 10x Genomics laden (Figuur 4). Als dit monster meer dan 1 miljoen cellen had en een levensvatbaarheid van minder dan 10% had, zou in plaats daarvan de dode celverwijdering - Kit 2 zijn gebruikt (Figuur 5). Het monster werd gewassen met isolatiemedia en 10 μL Annexine V en biotineselectiecocktail werden toegevoegd, gevolgd door 20 μL magnetische bollen en 60 μL isolatiemedia, zoals beschreven in protocolsectie 6 (Figuur 4). Na deze procedure werd het monster opnieuw gesuspendeerd in 500 μl media en opnieuw geteld. Het aantal levende cellen was 4,9 × 105/ml met een levensvatbaarheid van meer dan 90% (figuur 3B), en het monster ging onmiddellijk over tot het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de verwerking van tumormonsters. (A) Illustratie van het stapsgewijze proces van het weefseldissociatieprotocol. (B) De vergisting van een monster met behulp van een verticaal geplaatste thermische mixer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig02.jpg"> Figuur 2: Pre-ACK en Post-ACK behandeling van een licht gepigmenteerd melanoommonster. (A) Afbeelding toont een melanoommonster dat na de verteringsstap is gefilterd en gepelleteerd vóór lysis van rode bloedcellen (RBC) met behulp van ACK. (B) Afbeelding toont hetzelfde melanoommonster na verwijdering van RBC met behulp van ACK-buffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig03.jpg"> Figuur 3: Weergave van cellen op de hemocytometer onder trypanblauw ingezoomd op een vergroting van 200x. (A) Afbeelding van het verschijnen van blauwe cellen vóór levende celverrijking, die dode cellen vertegenwoordigt, met een levensvatbaarheid van minder dan 80%. (B) Afbeelding van het monster na verrijking van levende cellen met behulp van het Kit 1-protocol (protocolstap 6), met een verhoogde levensvatbaarheid van meer dan 90%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig04.jpg"> Figuur 4: Overzicht van de isolatie van levend-dode monstercellen met behulp van Kit 1. Deze stap wordt uitgevoerd wanneer minder dan een miljoen of meer dan een miljoen cellen met een levensvatbaarheid >10% worden gedetecteerd na celtelling (protocolstap 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig05.jpg"> Figuur 5: Overzicht van de isolatie van levende dode cellen met behulp van de microbeads voor het verwijderen van dode cellen in Kit 2. Deze stap wordt uitgevoerd wanneer er meer dan een miljoen cellen zijn en een levensvatbaarheid van <10%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig06.jpg"> Figuur 6: Validatie van eencellige analyse van een niet-gemanipuleerd monster na één cyclus van verrijking van levende cellen met behulp van het gewijzigde protocol van Kit 1. Het bovenste deel toont een UMAP-analyse die consistentie aantoont in celgroepen en -typen voor en na levende celverrijking. Het onderste deel geeft een overzicht van de sequencing-outputs die door Cell Ranger worden gegenereerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol schetst de procedure voor het snel dissociëren van tumormonsters van mensen en muizen voor sequencing van enkelcellig RNA.

Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

Human tumor samples hold a plethora of information about their microenvironment and immune repertoire. Effective dissociation of human tissue samples into ...

dissociation-human-mouse-tumor-tissue-samples-for-single-cell-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

Humane tumor xenotransplantaten zijn gevasculariseerd en geïnfiltreerd door cellen van muizen oorsprong tijdens de groeifase in vivo. Om de voorspanning door deze contaminerende cellen tijdens downstream analyse te omzeilen, hebben wij een methode waardoor uitgebreide depletie van muizencellen door magnetische celsortering.

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Er wordt een algemeen protocol opgesteld voor de gecombineerde enzymatische en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van weefsels om eencellige suspensies te genereren voor stroomafwaartse analyses, zoals flowcytometrie. Instructies voor de fabricage, montage en bediening van het goedkope mechanische apparaat dat voor dit protocol is ontwikkeld, zijn inbegrepen.

Mechanische dissociatie van weefsels voor analyse van één cel met behulp van een gemotoriseerd apparaat

Deze studie presenteert twee cruciale experimentele technieken: de constructie van een muiswondmodel voor het beoordelen van wondsluiting en de voorbereiding van suspensies van enkele cellen uit muishuid om de celviabiliteit te behouden.

Muizenwondmodellen en het bereiden van single-cell suspensies

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode om hoogwaardige eencelsuspensies te isoleren uit zowel gezond als tumordragend muislongweefsel. Dit protocol kan worden toegepast op scRNA-seq, flowcytometrie-analyse en primaire celisolatie.

Geoptimaliseerde voorbereiding van heel muis tumordragend longweefsel voor flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer hoe u tumorweefselmonsters van mensen en muizen snel dissocieert voor eencellige RNA-sequencing. Deze methode helpt onderzoekers de immuunrespons tegen tumoren te bestuderen en voorspellers van therapieresistentie te identificeren.

Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

Meer video's verkennen