Name: Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer mitochondriën isoleren uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters voor supercomplexanalyse. Deze methode analyseert ademhalingscomplexen en ondersteunt onderzoek naar mitochondriale biogenese en ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidienummer "PGC2018-095795-B-I00" van het Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) en door subsidies "Grupo de Referencia: E35_17R" en subsidienummer "LMP220_21" van Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) aan PF-S en RM-L.

Mitochondriale fractionering in kleine weefselmonsters voor supercomplexe analyse

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De methodologische aanpassingen die in de hier beschreven protocollen zijn geïntroduceerd, zijn bedoeld om verliezen te voorkomen en de opbrengst te verhogen met behoud van mitochondriale complexe activiteiten (wat cruciaal is wanneer de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters in het gedrang komt) en om het verwachte patroon van SC's van het weefsel of de cellijn te reproduceren (zie figuur 2C). Met dit doel en aangezien een hoge mitochondriale zuiverheid niet vereist is om de SC's goed te detecteren, is het aantal stappen, tijden en volumes verminderd wanneer dit mogelijk was.
Dus, na homogenisatie en verwijdering van kernen en ongebroken cellen door centrifugatie met lage snelheid, worden de supernatanten die de mitochondriën bevatten, overgebracht naar polypropyleenbuizen van 1,5 ml, en de daaropvolgende centrifugaties om de ruwe mitochondriale fracties te verkrijgen, worden uitgevoerd in een microfuge door de snelheid te verhogen en de tijden en volumes te verminderen ten opzichte van conventionele protocollen. Dit maakt de verwerking van meerdere monsters in een relatief korte tijd mogelijk: een nauwkeurige schatting is dat 10 monsters kunnen worden verwerkt in ~2-2,5 uur (vanaf het begin van de homogenisatie (protocolstap 1.6. of equivalent voor weefsels) tot het verkrijgen van de SCs-fractie die klaar is om in een gel te worden geladen (protocolstap 3.7) en minimaliseert de verliezen tijdens het behouden van activiteiten. Een andere verandering ten opzichte van de oorspronkelijke protocollen van de Schägger-groep is om, na membraansolubilisatie voor het verkrijgen van de SCs-fractie, een ultracentrifugatiestap te vervangen door een eenvoudige microfuge-centrifugatie (protocolstap 3.4).
Er zijn enkele cruciale stappen in de procedure. Ten eerste de efficiëntie van celbreuk, vooral in het geval van gekweekte cellen (zie opmerking na protocolstap 1.8) en in het bijzonder in het geval van kleine cellen. Weefsels en cellijnen vertonen een variabele moeilijkheidsgraad bij celbreuk: in het hart en de spieren is deze stap bijvoorbeeld meestal minder efficiënt dan in de lever of milt, maar het wordt gecompenseerd in opbrengst omdat de eerste een hoger mitochondriaal gehalte hebben. Een alternatief om de mitochondriale opbrengst te verbeteren wanneer geïsoleerd uit spier of hart, is de behandeling van monsters met trypsine vóór homogenisatie. De hersenen zijn een ander weefsel dat een lage efficiëntie vertoont bij celbreuk vanwege de handmatige homogenisatie, die milder en minder efficiënt is en waarschijnlijk ook vanwege de hogere variatie in celtypen in dit weefsel, zoals eerder is gemeld 42. Dit kan gedeeltelijk worden gecompenseerd door een tweede homogenisatiestap zoals voorgesteld in ons protocol (stap 2.7.4). Aan de andere kant, als de celbreuk buitensporig is, kan het uiteindelijke monster dat SC's bevat, besmet zijn met nucleaire DNA-fragmenten die de elektroforetische werking kunnen verstoren. Dit probleem wordt getoond als een toename van de viscositeit van het monster wanneer digitonine wordt toegevoegd om de mitochondriale membranen op te lossen en kan worden opgelost door behandeling met DNAse I.
Ten tweede, als de verhouding tussen detergent en eiwit te laag is, zou dat resulteren in een minder efficiënte membraanoplosbaarheid en de mogelijkheid van aggregaatvorming. Dit kan in de gels tot uiting komen in een slechte resolutie in SC's met een hoog molecuulgewicht (zie figuur 4) of in CIV die meerdere banden geeft die overeenkomen met oligomeren43. Als de verhouding te hoog is, kan dit leiden tot uitsplitsing van SC's (voornamelijk CI-SC's). Ten derde is het belangrijk om het verhitten van monsters tijdens de hele procedure te vermijden (zie figuur 4) en herhaalde cycli van invriezen en ontdooien te vermijden, aangezien deze de SC-assemblagestatus kunnen beïnvloeden.
In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de verwachte opbrengsten voor verschillende celtypen en weefselmonsters. De waarden zijn bij benadering en zijn afhankelijk van de efficiëntie van de celbreuk en de aard van de bron. In het geval van weefsels heeft het uitgangsmateriaal de neiging om een hogere opbrengst te geven dan bij verse monsters. Er wordt een schatting gegeven van het aantal banen (uitgaande van een belasting tussen 50 en 60 μg mitochondriaal eiwit per baan) dat kan worden belast.
De hier gepresenteerde protocollen hebben betrekking op een verscheidenheid aan weefsels en celtypen met kleine variaties, ze kunnen worden gebruikt met verse of bevroren monsters en vereisen eenvoudige apparatuur en relatief lage kosten, waarbij geen dure zuiveringskits of gradiënten worden gebruikt. Ze kunnen echter enkele aanpassingen nodig hebben om te worden gebruikt met bepaalde celtypen of monsters, evenals wanneer specifieke mitochondriale populaties, zoals synaptische mitochondriën in de hersenen of subsarcolemmale mitochondriën van spieren, bijvoorbeeld het object van analyse zijn.
Aangezien de precieze fysiologische rollen en de mogelijke betrokkenheid van SC's bij pathologische situaties nog moeten worden gedefinieerd, is een analyse nodig van hun dynamiek en de factoren die van invloed zijn op hun assemblage, stabiliteit en functie. Onze protocollen kunnen waardevolle hulpmiddelen zijn die het mogelijk maken om reproduceerbare resultaten te verkrijgen op de SCs-patronen met kleine steekproefgroottes en van een verscheidenheid aan celtypen en weefsels, vooral wanneer meerdere experimentele omstandigheden moeten worden vergeleken29.

Supercomplexen (SC's) zijn supramoleculaire associaties tussen individuele respiratoire ketencomplexen 1,2. Sinds de eerste identificatie van SC's en de beschrijving van hun samenstelling door de groep van Schägger 2,3, later bevestigd door andere groepen, werd vastgesteld dat ze respiratoire complexen I, III en IV (respectievelijk Ci, CIII en CIV) bevatten in verschillende stoichiometrieën. Er kunnen twee hoofdpopulaties van SC's worden gedefinieerd, die met CI (en ofwel CIII alleen of CIII en CIV) en met een zeer hoog moleculair gewicht (MW, beginnend met ~1,5 MDa voor de kleinere SC: CI + CIII2) en die met CIII en CIV maar niet met CI, met een veel kleinere omvang (zoals CIII2 + CIV met ~680 kDa). Deze SC's bestaan naast elkaar in het binnenste mitochondriale membraan met vrije complexen, ook in verschillende verhoudingen. Dus, terwijl CI meestal wordt aangetroffen in de geassocieerde vormen (dat wil zeggen, in SC's: ~80% in runderhart en meer dan 90% in veel menselijke celtypen)3, is CIV zeer overvloedig in zijn vrije vorm (meer dan 80% in runderhart), waarbij CIII een meer evenwichtige verdeling vertoont (~40% in zijn meer overvloedige vrije vorm, als een dimeer, in runderhart).
Hoewel hun bestaan nu algemeen wordt aanvaard, staat hun precieze rol nog ter discussie 4,5,6,7,8,9,10. Volgens het plasticiteitsmodel kunnen er verschillende verhoudingen van SC's en individuele complexen bestaan, afhankelijk van het celtype of de metabole status 1,7,11. Deze dynamische aard van de assemblage zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van het oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) te reguleren als reactie op veranderingen in het milieu 4,5,7. SC's kunnen ook bijdragen aan het beheersen van de generatiesnelheid van reactieve zuurstofsoorten en deelnemen aan de stabilisatie en omzet van individuele complexen 4,12,13,14. Veranderingen van de SC-assemblagestatus zijn beschreven in verband met verschillende fysiologische en pathologische situaties15,16 en met het verouderingsproces17.
Zo zijn er veranderingen in de SC-patronen beschreven in gist, afhankelijk van de koolstofbron die wordt gebruikt voor groei2 en in gekweekte zoogdiercellen wanneer glucose wordt vervangen door galactose4. Modificaties zijn ook gemeld in de lever van muizen na vasten8 en in astrocyten wanneer de oxidatie van mitochondriale vetzuren wordt geblokkeerd18. Daarnaast zijn er een afname of veranderingen in SC's en OXPHOS gevonden bij Barth-syndroom19, hartfalen20, verschillende metabole21 en neurologische 22,23,24 aandoeningen en verschillende tumoren 25,26,27,28. Of deze veranderingen in de samenstelling en niveaus van SC een primaire oorzaak zijn of secundaire effecten vertegenwoordigen in deze pathologische situaties, wordt nog onderzocht15,16. Verschillende methodologieën kunnen informatie geven over de samenstelling en functie van SC's; Deze omvatten activiteitsmetingen 8,29, ultrastructurele analyse30,31 en proteomics 32,33. Een bruikbaar alternatief dat steeds vaker wordt gebruikt en het uitgangspunt vormt voor enkele van de eerder genoemde methodologieën, is de directe bepaling van de SC-assemblagestatus door middel van Blue native (BN) elektroforese die voor dit doel is ontwikkeld door Schäggers groep34,35.
Deze aanpak vereist reproduceerbare en efficiënte procedures om mitochondriale membranen te verkrijgen en op te lossen en kan worden aangevuld met andere technieken zoals in-gel activiteitsanalyse (IGA), tweede-dimensie elektroforese en western blot (WB). Een beperking in de studies naar SC-dynamica door BN-elektroforese kan de hoeveelheid startcellen of weefselmonsters zijn. We presenteren een reeks protocollen voor de analyse van de assemblage en functie van SC, aangepast aan de groepsmethoden van Schägger, die kunnen worden toegepast op verse of bevroren cel- of weefselmonsters vanaf slechts 20 mg weefsel.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Aminocapronzuur</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blauw G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blauw R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; benzeen (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Vrije vetzuren BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator Teflon stamper</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Monoklonaal Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 tot 12% Mini Eiwit Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Kathode Buffer Additief (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Loop Buffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Monoklonaal Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblauw tetrazoliümzout (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF Membraan</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Fenazine methazulfaat (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substraat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Monoklonaal Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine/penicilline</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Monoklonaal Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

In de afgelopen decennia heeft het verzamelde bewijs over het bestaan van respiratoire supercomplexen (SC's) ons begrip van de organisatie van de mitochondriale elektronentransportketen veranderd, wat aanleiding heeft gegeven tot het voorstel van het 'plasticiteitsmodel'. Dit model veronderstelt het naast elkaar bestaan van verschillende verhoudingen van SC's en complexen, afhankelijk van het weefsel of de cellulaire metabolische status. De dynamische aard van de assemblage in SC's zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van elektronenoverdracht te optimaliseren, waardoor de productie van reactieve zuurstofsoorten wordt geminimaliseerd en het vermogen van cellen om zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving wordt bevorderd. 
Meer recentelijk zijn afwijkingen in de SC-assemblage gemeld bij verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer en Parkinson), het Barth-syndroom, het Leigh-syndroom of kanker. De rol van veranderingen in de SC-assemblage in de progressie van de ziekte moet nog worden bevestigd. Toch is de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters om de SC-assemblagestatus te bepalen vaak een uitdaging. Dit gebeurt met biopsie of weefselmonsters die klein zijn of moeten worden verdeeld voor meerdere analyses, met celculturen die langzaam groeien of afkomstig zijn van microfluïdische apparaten, met sommige primaire culturen of zeldzame cellen, of wanneer het effect van bepaalde dure behandelingen moet worden geanalyseerd (met nanodeeltjes, zeer dure verbindingen, enz.). In deze gevallen is een efficiënte en gemakkelijk toe te passen methode vereist. Dit artikel presenteert een methode die is aangepast om verrijkte mitochondriale fracties te verkrijgen uit kleine hoeveelheden cellen of weefsels om de structuur en functie van mitochondriale SC's te analyseren door middel van natuurlijke elektroforese, gevolgd door in-gel activiteitstesten of western blot.

De opbrengsten van mitochondriën verkregen volgens de hierboven beschreven protocollen variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals de cellijn of het weefseltype, de aard van de monsters (d.w.z. of verse of bevroren weefsels worden gebruikt) of de efficiëntie van het homogenisatieproces. Verwachte opbrengsten van mitochondriën uit verschillende cellijnen en weefsels zijn verzameld in Tabel 2. Zodra de mitochondriale fracties zijn verkregen, is de volgende stap de analyse van het respiratoire SCs-patroon, die wordt uitgevoerd na de ruwe mitochondriale monstersolubilisatie en elektroforetische scheiding door BN-PAGE, gevolgd door IGA-analyse of WB-immunodetectie. Figuur 1 toont het aspect van ongekleurde gelbanen net na de run en het patroon van banden na standaard Coomassie kleuring van een gekweekte cellijn en een mitochondriaal levermonster van muizen.
In figuur 2A,B zijn duidelijke verschillen waarneembaar tussen de SC-assemblagepatronen in menselijke en muiscellen na gebruik van IGA-assays. Zo wordt vrij complex I waargenomen in muizencellen, terwijl het niet detecteerbaar is in menselijke mitochondriën. Het complexe IV-IGA-patroon lijkt sterk op elkaar in beide menselijke cellijnen (Figuur 2B), terwijl het verschillen vertoont tussen de twee muiscellijnen die in Figuur 2A zijn geanalyseerd. Deze verschillen zijn te wijten aan het feit dat BL6-cellen een mutante variant van SCAF18 tot expressie brengen.
De SC-patronen, verkregen met het hier beschreven protocol voor mitochondriale isolatie om met kleine monsters te werken, worden gehandhaafd ten opzichte van de "conventionele" protocollen die worden gebruikt voor grotere monsters. Dit is te zien in figuur 2C, door banen 1 en 6 (verkregen na mitochondriale isolatie met behulp van een conventioneel protocol van 3 g lever en 1,1 g BBT) te vergelijken met respectievelijk banen 2 en 5 (verkregen met behulp van de hier gepresenteerde protocollen van ongeveer 0,1 g van beide weefsels). Zoals voorgesteld in het plasticiteitsmodel, varieert het relatieve aandeel van respiratoire complexen en SC's afhankelijk van het celtype en de metabolische toestand. Zoals te zien is in figuur 2C,D, vertonen de verschillende weefsels verschillende SC-assemblagepatronen. Zo vertonen mitochondriën in de hersenen zeer lage niveaus van vrij complex I en een hoger aandeel SC's in vergelijking met de andere weefsels, en BAT wordt gekenmerkt door zijn lage niveaus van CV (Figuur 2A) en hoge hoeveelheden SC III + IV (Figuur 2D). Hartmitochondriën vertonen hoge niveaus van SC's en CV. CV-assemblagepatronen zijn zeer vergelijkbaar tussen de gekweekte cellijn en een mitochondriaal monster van een muizenlever (Figuur 2E).
SC-assemblage kan ook worden geanalyseerd door WB, zoals weergegeven in figuur 3 voor twee monsters die zijn verkregen uit miltcontrole en tumorcellen. In dit geval is 30-50 μg mitochondriaal eiwit meestal voldoende om de verschillende complexen en SC's met de specifieke antilichamen te detecteren. Figuur 4 toont enkele van de belangrijkste valkuilen die zich kunnen voordoen tijdens de toepassing van deze protocollen. Verkeerde gelgradiënten kunnen abnormale en ongewenste migratiepatronen veroorzaken, zoals in figuur 4A, baan 1, waarbij de SC's dicht bij de put in het bovenste deel van de baan blijven vanwege een hoger dan normale acrylamideconcentratie in de gel. Incubatie van de monsters, zelfs voor relatief korte tijden, bij hoge temperaturen (hier 37 °C en 40 °C gedurende 10 minuten) veroorzaakt degradatie van SC's en CI (figuur 4A , banen 2-4). Evenzo is de verhouding tussen wasmiddel en eiwit van cruciaal belang voor goede resultaten en een adequate gelresolutie. Onder een verhouding van 2 g digitonine/g eiwit wordt de bandresolutie geleidelijk verminderd en bij de lagere concentratie (0,5 g/g) is alleen een uitstrijkje zichtbaar in het gebied dat overeenkomt met SC's (figuur 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Figuur 1: Patroon van mitochondriale complexen en supercomplexen na BNGE-scheiding van digitonine-permeabiliseerde mitochondriën uit een kweekcellijn (L929Balbc) en muizenlever. De rijstroken aan de linkerkant (1 en 2) vertegenwoordigen het aspect van de ongekleurde gel net na de run, waar alleen CV detecteerbaar is, terwijl de banen aan de rechterkant (3 en 4) het patroon van banden na Coomassie kleuring vertonen. Afkortingen: BNGE = Blue Native gel elektroforese; CV = complex V; SC's = supercomplexen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Figuur 2: IGA-analyse van mitochondriën geïsoleerd uit verschillende cellijnen en muizenweefsels. (A,B) In-gel activiteit van de geïndiceerde complexen in mitochondriën geïsoleerd uit (A) muizen of (B) menselijke cellijnen. L929Balbc is een transmitochondriale cellijn die in ons laboratorium wordt gegenereerd door mitochondriën over te brengen van Balb/cJ-muisbloedplaatjes naar ρ°L929neo-cellen, zoals eerder beschreven40,41. BL6-fibroblasten zijn een onsterfelijke cellijn die in ons laboratorium is gegenereerd uit een oorbiopsie van een BL6-muis. (C) CI-IGA-patronen uit mitochondriën van muizen geïsoleerd met behulp van een conventionele methode die begint met 3 g lever (baan 1) en met 1,1 g BAT (baan 6) of het hier gepresenteerde protocol en begint met ongeveer 0,1 g weefsel in alle gevallen (baan 2, lever; baan 3, hart; baan 4, hersenen en baan 5 BAT). (D) CIV-IGA-patronen (uitgevoerd na CI-IGA getoond in panel 2C, banen 2-5) in de lever, het hart, de hersenen en de BAT-mitochondriën van muizen. (E) CV-IGA-activiteit geanalyseerd in gekweekte cellen van muizen en lever. Ongeveer 60-75 μg mitochondriaal eiwit per baan werd geladen. Afkortingen: IGA = in-gel activiteit; SC's = supercomplexen; BI = complex I; BAT = bruin vetweefsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Figuur 3: WB immunodetectie van de verschillende mitochondriale complexen en supercomplexen in miltmonsters. Na Blue Native PAGE-scheiding van mitochondriale complexen en SC's verkregen uit miltcontrole- (Milt M9) en tumormonsters (Tumor M9), werden ze overgebracht naar een PVDF-membraan en achtereenvolgens gehybridiseerd met antilichamen die de aangegeven CI-, CIII-, CIV- en CII-subeenheden herkennen (respectievelijk panelen AD). Per baan werd ongeveer 50 μg mitochondriaal eiwit geladen. Sterretjes geven het signaal aan dat overblijft van een eerdere westelijke vlek. Afkortingen: SC = supercomplex; BI = complex I; CIII = complex III; CIV = complex IV; CII = complex II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Figuur 4: Valkuilen in SC analyse door Blue-Native PAGE. CI IGA-analyse van mitochondriën geïsoleerd uit (A) verse muizenlever en (B) bevroren rattenlever onder verschillende oplosbaarheidsomstandigheden. (A) Baan 1, verkeerde gelgradiëntconcentratie (8-13% in plaats van de normale 3-13%). Banen 2-4, monsters die gedurende 10 minuten op ijs of bij respectievelijk 37 °C en 40 °C zijn geïncubeerd voordat ze worden geladen. (B) Patroon na IGA voor CI van mitochondriën verkregen uit bevroren rattenlever met behulp van verschillende digitonine/eiwitverhoudingen voor oplosbaarheid. Afkortingen: SC = supercomplex; PAGE = elektroforese van polyacrylamidegel; BI = complex I; IGA = in-gel activiteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gemiddeld</td>
			<td colspan="3">Compositie</td>
		</tr><tr><td>Hypotone buffer</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM sucrose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Hypertone buffer</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM sucrose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Homogenisatie Buffer A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sucrose, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Homogenisatie Buffer AT</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sucrose, 0,01% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Homogenisatie Buffer AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sucrose, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>BN monster buffer</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 2 mM Aminocapronzuur, 1 mM EDTA pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Digitonin-oplossing</td>
			<td colspan="3">10% digitonine in 50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM Aminocapronic, 4 mM PMSF</td>
		</tr><tr><td>BN laadbuffer</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G in 0,75 M aminocapronzuur</td>
		</tr><tr><td>BN kathodebuffer A</td>
			<td colspan="3">50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (Coomassie briljant blauw G-250)</td>
		</tr><tr><td>BN kathodebuffer B</td>
			<td colspan="3">50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr><tr><td>BN anode buffer</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>Complex I IGA-substraat</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/ml NADH, 2,5 mg/ml Nitroblauw Tetrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Complex II IGA-substraat</td>
			<td colspan="3">50 mM Kaliumfosfaatbuffer pH 7,4, 20 mM natriumsuccinaat, 0,2 mM fenazinemethosulfaat (PMS), 2,5 mg/ml NBT</td>
		</tr><tr><td>Complex III IGA-substraat</td>
			<td colspan="3">50 mM Kaliumfosfaatbuffer pH 7,2, 0,05% diaminobenzidine (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Complex IV IGA-substraat</td>
			<td colspan="3">Zelfde oplossing als CIII plus 50 μM cytochroom c</td>
		</tr><tr><td>Complex V IGA-substraat</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glycine pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Kleuring oplossing</td>
			<td colspan="3">Coomassie kleurstof R-250 op 0,25% in 40% methanol en 10% azijnzuur</td>
		</tr><tr><td>Ontkleurings-/fixeeroplossing</td>
			<td colspan="3">40% methanol, 10% azijnzuur</td>
		</tr><tr><td>Buffer overdragen</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM Glycine, 20% methanol</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Buffers en mediasamenstelling.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Celtype/weefsel</td>
			<td>Startbedrag</td>
			<td>Verwachte opbrengst (μg mitochondriaal eiwit)</td>
			<td>Aantal rijstroken (50-60 μg/baan)</td>
		</tr><tr><td>Gekweekte cellen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>143B-afgeleid</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblasten van muizen</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Hart</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Skeletspier</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Lever</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Milt</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>VLEERMUIS</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Hersenen</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Verwachte opbrengsten van mitochondriën van verschillende celtypen en muizenweefsels. De mitochondriale fracties die uit het hart of de skeletspieren worden verkregen, zijn zuiverder dan die uit andere weefsels. Zo kunnen kleinere hoeveelheden in de gels worden geladen (*).

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Ons onderzoek is gericht op een beter begrip van mitochondriale biogenese, in het bijzonder de organisatie en regulatie van het OXPHOS-systeem, en ook op het definiëren van de rol die mitochondriën spelen bij ziekten van kanker tot neurodegeneratieve aandoeningen. Mitochondriën vervullen meerdere en essentiële rollen in de cel en conditioneren het hele metabolisme en de overleving. We vergroten langzaam onze kennis van mitochondriale complexiteit en de bijdrage ervan aan celaanpassingsmechanismen in gezondheid en ziekte.We hebben bijgedragen aan het opzetten van een nieuw organisatiemodel voor het OXPHOS-systeem, het plasticiteitsmodel dat eerdere voorstellen integreert en uitgaat van het naast elkaar bestaan van supercomplexen en vrije complexen in verschillende verhoudingen om de functie ervan te optimaliseren en cellulaire aanpassingen mogelijk te maken. Ons protocol maakt het mogelijk om te beginnen met kleine weefsels of celcultuurmonsters om voldoende mitochondriale eiwithoeveelheden te verkrijgen om de assemblage en status en functie van supercomplexen te analyseren door middel van blauwe native elektroforese of andere technieken. Dit kunnen we in korte tijd reproduceerbaar doen met een eenvoudige apparatuur en relatief tegen lage kosten.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the procedure for isolating mitochondria from human ovarian cancer tissues using differential-speed centrifugation in combination with density gradient centrifugation. The isolated mitochondria can be used for proteomic analysis of human ovarian cancer mitochondrial proteome.

Mitochondrial Isolation: A Technique to Isolate Mitochondria from Human Ovarian Cancer Tissue Sample

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondriën zijn ribosomen die afweek van hun tegenhangers bacteriële en cytoplasmatische gespecialiseerd. Hier laten we zien hoe de mitoribosomes van hun inheemse compartiment in HEK cellen kan worden verkregen. Bij deze methode wordt isolatie van mitochondriën uit schorsing cellen en daaruit voortvloeiende zuivering van mitoribosomes.

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

Leer mitochondriën isoleren uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters voor supercomplexanalyse. Deze methode analyseert ademhalingscomplexen en ondersteunt onderzoek naar mitochondriale biogenese en ziekten.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters

Meer video's verkennen