Opstelling van een minimaal invasief rattenmodel van longembolie met behulp van autologe bloedstolsels

Het doel van ons onderzoek is het verbeteren van de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van knaagdiermodellen voor longembolie die de menselijke pathofysiologie nabootsen. We willen beantwoorden hoe minimaal invasieve technieken worden gebruikt voor het induceren van PE-modellen, in de hoop dat ze de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën vergemakkelijken. Onze protocollen genereren op een standaardmanier autologe bloedstolsels en induceerden chirurgische PE-modellen van knaagdieren met minimale invasiviteit, waardoor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van PE-dierproeven wordt verbeterd. We hebben onthuld dat de oplossing van stolsels snel is bij knaagdieren. Dit verklaart waarom een chronisch trombo-embolisch pulmonale hypertensiemodel moeilijk op te zetten is. De visualisatietechnieken voor stolsels zullen als leidraad dienen voor de ontwikkeling van een betrouwbaar CTAP-diermodel. Wij zijn een gezamenlijk laboratorium van zowel biomedische technologie als een klinisch cardiovasculair team. Met dit model zal ons lab zich richten op het ontwikkelen van nieuwe trombo-embolische en complicatiepreventiestrategieën voor PE op basis van geavanceerde tot biomateriaaloplossingen.

[Verteller] Om te beginnen plaatst u het verdoofde dier in rugligging op het operatieplatform. Strek beide vier ledematen horizontaal uit het lichaam en strek de achterpoten uit om de liesstreek adequaat bloot te leggen. Zet het dier met medische tape vast in deze positie. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar rond het borstbeen en de lies te scheren. Smeer vervolgens ontharingscrème op het achtergebleven haar en desinfecteer de huid drie keer met povidonjodium. Steek een naald van 27 gauge die is bevestigd aan een spuit van één milliliter verticaal in tot een diepte van acht millimeter om de linker- of rechterschedelvena cava te doorboren. Houd vervolgens de spuit vast en trek de zuiger voorzichtig terug om onderdruk in het vat te creëren. Trek de naald geleidelijk terug totdat het bloed naar binnen stroomt. Houd die positie vervolgens vast totdat er 0,3 milliliter bloed is verzameld. Voor de bereiding van bloedstolsels duwt u het verzamelde bloed in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Zuig vervolgens het bloed in de siliconen slang van de zelfgemaakte trombusgenerator tot de bloedkolom 10 centimeter lang is. Wacht 30 minuten om het bloed te laten stollen. Spoel vervolgens de trombusbloedkolom in een petrischaaltje met normale zoutoplossing. Knip daarna met een fijne schaar de trombuskolom in uniforme bloedstolsels van elk vier millimeter lang. Zuig 15 tot 25 stolsels op in de zelfgemaakte injector die is voorgevuld met twee milliliter normale zoutoplossing. Maak na het desinfecteren van het operatiegebied van de verdoofde rat een incisie van vijf millimeter in de huid boven de oorsprong van de oppervlakkige epigastrische vaten in de liesstreek. Gebruik een stereomicroscoop met een vergroting van 10x en scheid een dunne laag onderhuids vet om de oppervlakkige epigastrische vaten bloot te leggen. Isoleer de oppervlakkige epigastrische ader zorgvuldig van de slagader, zenuw en vetweefsel. Beheers vervolgens de distale zijde met een 8-0 Hecht steriel en klem de hechtdraad vast met een microklem. Beheers de proximale zijde met een 8-0 Steriele hechtlus bevestigd aan een andere microklem. Bind de distale lus vast en doorsnijd de ader met een cauterisator. Maak vervolgens een kleine transversale incisie aan de distale zijde van de geïsoleerde ader en spoel het resterende bloed in het aderlumen met normale zoutoplossing. Zodra de ader vrij is, gebruikt u een micropincet om de veneuze incisie te vergroten. Voor embolisatie steekt u voorzichtig de naald van de zelfgemaakte injector in de ader via de aderincisie. Zet de naald vast met een derde klem om te voorkomen dat deze uit de ader glijdt. Druk vervolgens langzaam op de zuiger om een kleine hoeveelheid normale zoutoplossing toe te dienen. Blijf op de zuiger drukken om stolsels in de dijbeenader toe te dienen via de oppervlakkige epigastrische adertoegang. Ligate de ader met de proximale hechting. Hecht ten slotte de incisie vast. Na het euthanaseren van de rat met een overdosis isofluran, snijdt u de ribben af met een grote schaar en opent u de borstkas, waardoor schade aan de longen en grote bloedvaten wordt voorkomen. Steek nu de naald van het infuusapparaat in de linker hartkamer. Open de klep van het infuusapparaat om gehepariniseerde infusie met zoutoplossing mogelijk te maken. Knip met een schaar de inferieure vena cava en het linker aanhangsel af om drainage mogelijk te maken. Regel de perfusiesnelheid met 50 milliliter per minuut. Na perfusie prikt u met een spuit van 10 milliliter gevuld met een paraformaldehyde-oplossing van vier procent de longslagaderstam door de rechterventrikel. Fixeer het longweefsel door vier procent paraformaldehyde-overvloedigheid door de longen uit te voeren voor een totaal volume van 30 milliliter. Voor visualisatie van de pulmonale arteriële boom voegt u een gelijke hoeveelheid verdunningsmiddel toe aan de siliconengietmassa. Voeg na het mengen van het mengsel vijf procent uithardingsmiddel toe en meng het mengsel opnieuw. Zuig vervolgens een milliliter van het mengsel op in een spuit van één milliliter. Laat de lucht leeglopen en steek de naald via de rechterventrikel in de longslagader. Druk voorzichtig op de zuiger zodat het siliconengietmengsel de longslagader kan vullen. Doe de hele massa in een petrischaal voordat je hem een nacht in een koelkast van vier graden Celsius bewaart om het gietmengsel te laten kristalliseren. Dompel de longen achtereenvolgens onder in 25%, 50%, 75%, 95% en 100% ethylalcoholoplossingen elk gedurende 24 uur. Dompel de gedehydrateerde longen 24 uur onder in methylsalicylaat. Onmiddellijk na de embolisatie vertoonden de geëxtraheerde longen autologe bloedstolsels en gebieden met een longinfarct. Een hogere belasting van embolieën resulteerde in een groter gebied van een longinfarct. Vergeleken met longmonsters die onmiddellijk na embolisatie werden genomen, vertoonden de longmonsters die 24 uur na embolisatie werden verzameld duidelijk verminderde infarcten, wat wijst op een sterk intrinsiek fibrinolysepotentieel bij ratten. Deze figuur toont de longslagaderboom na het gieten en het opruimen van weefsel voor normale longen en voor longembolieën.