Name: Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Leer een orthotopisch NSCLC-xenotransplantaatmodel opzetten met meercellige sferoïden van fluorescerende A549-iRFP-cellen. Deze methode bootst klinische ziektestadia na en voorspelt cisplatine-respons via dynamische in vivo beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door SAAG- en SEED-beurzen van de University of the Pacific. We danken Dr. William Chan voor het verlenen van toegang tot het Odyssey Infrared Imaging 205 System en Dr. John Livesey voor het verlenen van toegang tot de SpectraMax iD3 plaatlezer. Wij danken Dr. Melanie Felmlee voor het technisch advies over de dierprotocollen.

De dierstudie werd uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of the Pacific (Animal Protocols 19R10 en 22R10). Acht mannelijke athymische naaktmuizen van 5-6 weken oud, met een gewicht van 20-25 g, gefokt met het genoemde knaagdierdieet en gehuisvest onder pathogeenvrije (SPF) omstandigheden, werden gebruikt voor de huidige studie. Kooien, beddengoed en drinkwater werden regelmatig geautoclaveerd en vervangen. Een schema van tumorinoculatie bij muizen is weergegeven in figuur 1. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Oprichting van driedimensionale MCS van A549-iRFP-cellen
<ol><li>Incubeer A549-iRFP-cellen (humaan longadenocarcinoom) in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C en kweek ze in volledig groeimedium DMEM met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1 μg/ml puromycine.</li>
	<li>Zaad A549-iRFP-cellen in 96-well ultra-low attachment, sferoïde microplaat met ronde bodem bij een zaaidichtheid van 4.000 cellen/put, met behulp van 100 μL volledig groeimedium aangevuld met 0,3% collageen.</li>
	<li>Centrifugeer de microtiterplaten bij 300 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C om de MCS-vorming te vergemakkelijken. Onderzoek de MCS-morfologie onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen na centrifugatie worden samengevoegd.</li>
	<li>Voeg na 48 uur 100 μl volledig groeimedium toe aan elk putje om een totaal volume van 200 μl groeimedium per putje te verkrijgen.</li>
	<li>Vervang om de dag 100 μL groeimedium in elk putje door vers, compleet groeimedium.</li>
</ol>2. Karakterisering van A549-iRFP MCS
<ol><li>Observeer en beeld de MCS-morfologie met behulp van een microscoop en schat het MCS-volume door simulatie met de gerefereerde software van MATLAB op basis van de fasecontrastmicroscoopbeelden.<ol><li>Open één MCS-afbeelding in de ImageJ-software.</li>
		<li>Gebruik selecties uit de vrije hand om de rand van het MCS te selecteren en toe te voegen aan ROI Manager.</li>
		<li>Klik op Bewerken | Selectie | Masker maken.</li>
		<li>Klik op Bewerken | Omkeren.</li>
		<li>Klik op Bestand | Opslaan als | Tiff.</li>
		<li>Open de ReViSP-software.</li>
		<li>Open de opgeslagen TIFF-afbeelding door op Bladeren te klikken.</li>
		<li>Klik op Start om de MCS-simulatie te voltooien.</li>
	</ol></li>
	<li>Meet het iRFP-fluorescerende signaal met behulp van het infraroodbeeldvormingssysteem op het 700 nm-kanaal en kwantificeer het fluorescerende signaal met behulp van software (bijv. Image Studio).<ol><li>Open de Image Studio-software.</li>
		<li>Selecteer op het tabblad Kanalen 700 en Intensiteit = 5.</li>
		<li>Selecteer op het tabblad Scanbediening de optie 84 μm, Gemiddeld, 0,0 mm en Afbeelding spiegelen. Houd al het andere als standaard.</li>
		<li>Klik op Start om het scannen te starten.</li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeel en kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de 3D-cellevensvatbaarheidstest volgens het protocol van de leverancier.</li>
	<li>Beoordeel en kwantificeer cellulair eiwit met behulp van de BCA-test volgens het protocol van de leverancier.</li>
</ol>3. MCS-selectie voor tumorinoculatie
OPMERKING: Nadat MCS in sferoïde microplaten is gezaaid en gedurende 2-3 weken is gekweekt met regelmatige uitwisseling van groeimediums, selecteert u MCS met de volgende geschikte kenmerken voor tumorinoculatie.
<ol><li>Bekijk de MCS-morfologie onder een microscoop en kies MCS met een ronde vorm met over het algemeen gladde randen, maar met 5-10 ruwe knoppen (pijlen in figuur 2F) en een diameter binnen het bereik van 700-800 μm.</li>
	<li>Meet de iRFP-fluorescentie (zie stap 2.2) en selecteer de MCS waarvan de fluorescerende signalen binnen één standaarddeviatie van het gemiddelde liggen.</li>
</ol>4. Intrapulmonale MCS-inoculatie
OPMERKING: Gebruik 70% isopropylalcoholspray om het operatiestation en het gereedschap schoon te maken voordat u de dieren aanraakt.
<ol><li>Verdoof elke muis met een IP-injectie van 80 mg/kg ketamine en 12 mg/kg xylazine; Knijp met een tang in de muisvoeten om volledige anesthesie te garanderen.</li>
	<li>Injecteer 10 μL buprenorfinehydrochloride (0,3 mg/ml) subcutaan om de pijn te verminderen.</li>
	<li>Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de muis in een dorsale houding en zet de ledematen vast in een strekkende positie met tapes.</li>
	<li>Steriliseer de achterhuid met jodium- en alcoholdoekjes.</li>
	<li>Knip een incisie van 0,5-1 cm af met een chirurgische schaar aan de linkerachterkant (Figuur 1B). Gebruik voorzichtig een pincet om het spier- en vetweefsel te scheiden totdat de borstwand en longbeweging zichtbaar zijn.</li>
	<li>Breng een geselecteerde MCS van een microtiterplaat over in een glazen petrischaal met ijskoude PBS, met behulp van een pipet.</li>
	<li>Bevestig een naald van 20 G op een glazen spuit van 100 μL, koel ze voor op ijs en zuig 20 μL op van een voorgekoeld mengsel van PBS en Matrigel (1:1 v/v).</li>
	<li>Gebruik de spuit om snel één MCS uit de petrischaal op te zuigen in een minimaal volume PBS-Matrigel-mengsel, waarbij het MCS in het metalen deel van de naald blijft. OPMERKING: Houd de spuit en zuiger stevig vast om te voorkomen dat de MCS uit de naald glijdt.</li>
	<li>Steek de naald voorzichtig verticaal tussen twee ribben tot een diepte van ~3 mm en injecteer langzaam al het mengsel van 20 μL PBS en Matrigel dat het MCS bevat. OPMERKING: Vermijd overmatige kracht tijdens het inbrengen om schade aan de long, het vaatstelsel of het hart te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de naald en breng drievoudige antibiotische zalf aan op de wond.</li>
	<li>Sluit de incisie af met chirurgische clips, die na 2 weken moeten worden verwijderd. OPMERKING: Hecht de incisie niet omdat de hechtlijnen de fluorescentiebeeldvorming kunnen verstoren. De naaktmuizen kunnen na de operatie op natuurlijke wijze genezen.</li>
	<li>Leg het dier op een infrarood warmtekussen en bedek het met laboratoriumdoekjes om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Houd het dier minstens 30-60 minuten in de gaten totdat het wakker wordt en goed beweegt.</li>
	<li>Injecteer 10 μL buprenorfinehydrochloride (0,3 mg/ml) subcutaan 3x per dag gedurende de eerste 48 uur om de pijn te verminderen.</li>
</ol>5. Postoperatieve monitoring
<ol><li>Meet elke 3-4 dagen het lichaamsgewicht.</li>
	<li>Meet elke 3-4 dagen het iRFP-fluorescerende signaal van het tumorxenotransplantaat op een beeldvormingssysteem voor kleine dieren op een kanaal van 700 nm in vier houdingen: links, rechts, dorsaal en ventraal, terwijl de muizen onder narcose worden gehouden door inhalatie van isofluraan (stroomsnelheid: 1.5-2 l/min zuurstof met 1.5% isofluraan) gedurende 2-3 minuten.</li>
	<li>Kwantificeer de netto fluorescerende intensiteit van de xenotransplantaatkanker in vivo met behulp van software (bijv. Image Studio).<ol><li>Gebruik een vaste rechthoek (A1, 200 x 125 pixels) als bemonsteringsvenster voor het borstgedeelte van de muizen.</li>
		<li>Gebruik de functie uit de vrije hand om de vorm van de muizen binnen de rechthoek (A1) te traceren en meet de fluorescerende intensiteit (F1) in gebied A1.</li>
		<li>Gebruik een andere kleinere rechthoek (A2, 25 x 40 pixels) om de achtergrondfluorescentie (F2) van de muizen in het dijgebied te meten.</li>
		<li>Gebruik vergelijking (1) om de netto fluorescerende intensiteit van de xenotransplantaatkanker in elke muis te berekenen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

Intrapulmonale inoculatie van meercellige sferoïden om orthotope NSCLC te modelleren

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li>
<li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li>
<li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

De constructie van A549-iRFP MCS is een eenvoudige en zeer reproduceerbare laboratoriumprocedure en kan worden vertaald naar MCS-vorming voor meerdere cellijnen. Het MCS dat met behulp van centrifugatie en collageen wordt gegenereerd, vertoont binnen 3-4 dagen een meer integrale en solide-tumorachtige structuur. Deze methode zorgt voor de vorming van robuuste sferoïden die hun integrale structuur gedurende langere perioden behouden, meestal 2-3 weken of zelfs langer totdat kleine knoppen beginnen te verschijnen. Door gebruik te maken van centrifugatie en collageen hebben we de vorming van MCS gestandaardiseerd, waardoor hun consistentie en betrouwbaarheid in ons experimentele model worden gegarandeerd. Deze aanpak verbetert de reproduceerbaarheid van onze resultaten en minimaliseert de variabiliteit in de kinetiek van de tumorgroei, waardoor een robuuster platform wordt geboden voor het bestuderen van tumorbiologie en therapeutische interventies.
In tegenstelling tot traditionele 2D monolayer celculturen, kan 3D MCS over een veel langere periode groeien, in deze studie ten minste 6 weken. Om de groei en progressie van kanker te volgen, is een dynamische, kwantitatieve meting op lange termijn zeer nuttig. Veel bestaande 3D MCS-assays zijn destructief tijdens de metingen, waardoor hun bruikbaarheid voor evaluaties op lange termijn wordt beperkt. De niet-destructieve aard van het meten van de iRFP-fluorescerende signalen maakt een continue en langdurige monitoring van de groei van kankercellen in 3D MCS mogelijk. Deze functie is met name waardevol voor het beoordelen van de effecten van chronische blootstelling aan antikankermiddelen en voor het vastleggen van de dynamische evolutie van kankercellen in de loop van de tijd. De iRFP-fluorescerende signalen die door de A549-iRFP 3D MCS werden uitgezonden, vertoonden een sterke correlatie met traditionele kwantitatieve metingen van sferoïde groei, waaronder sferoïde volume, cellevensvatbaarheid en cellulaire eiwitniveaus. Dit benadrukt de betrouwbaarheid van de fluorescerende signalen als een proxy voor het beoordelen van de groei van kankercellen bij MCS. De lange golflengte van de iRFP-fluorescerende signalen maakt het mogelijk om de groei en progressie van kanker bij kleine dieren te kwantificeren, wat van cruciaal belang is voor de preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen tegen kanker.
Om de consistentie van dit orthotope NSCLC-model te garanderen, moet MCS zorgvuldig worden geselecteerd voor intrapulmonale inoculatie. Vergelijkbare grootte en fluorescerende intensiteit van het MCS zijn nodig om variatie te minimaliseren; inoculatie van grotere MCS heeft de neiging om grotere variatie in tumorprogressie te veroorzaken. Bovendien speelt het beheersen van de ruwheid van het MCS-oppervlak een cruciale rol bij het verminderen van de variatie. Terwijl sommige MCS hun gladde randen behielden naarmate ze groter werden, vertoonden andere ruwere randen naarmate ze groeiden. In onze handen leverde het integrale, solide-tumorachtige MCS na 2-3 weken groeien in celcultuur met 5-10 knoppen aan de randen een meer uniforme tumorgroei op bij muizen, terwijl die zonder ruwe randen of die met losgemaakte structuren en te veel knoppen meer diverse patronen van tumorgroei opleverden na inoculatie. 
Tijdens het proces van MCS-overdracht is het essentieel om de 20 G-naald met grote zorg te hanteren. MCS moet binnen de afschuining of het metalen deel van de naald worden gehouden om mogelijke schade te beperken. De keuze van de naalddikte is bewust gemaakt om een evenwicht te vinden tussen het waarborgen van de levensvatbaarheid van het MCS tijdens de inoculatie en het minimaliseren van de mogelijke schade aan de longen van muizen. Grotere naalddiktes kunnen mogelijk schade aan de muizenweefsels veroorzaken. Als MCS vast komt te zitten in de naald of als er in de eerste dagen na inoculatie meerdere fluorescerende stippen worden waargenomen, kan dit erop wijzen dat de geïnoculeerde MCS tijdens de inoculatie is beschadigd. Muizen die deze kenmerken vertoonden, werden uitgesloten van verdere studies en geclassificeerd als niet-succesvolle inoculatie.
De meercellige sferoïden (MCS) werden op basis van anatomische overwegingen in de linkerlong geënt in plaats van in de rechterlong. De linkerlong heeft twee lobben die op elkaar zijn gestapeld, wat zorgt voor een consistenter en toegankelijker doelgebied in vergelijking met de rechterlong, die drie lobben naast elkaar heeft. De linkerlong maakt dus een zeer betrouwbare inoculatie mogelijk in een specifiek gebied, namelijk de linkerbovenkwab, wat helpt om variaties in het ontstaan en de progressie van de tumor te verminderen. 
Naast de iRFP-fluorescentie van de borstkas dient het lichaamsgewicht van de tumordragende muizen als een belangrijke bevestigende indicator van de tumorbelasting. Naarmate de xenotransplantaatkanker vorderde na MCS-inoculatie, vertoonden de muizen eerst normaal gedrag, waaronder eten, drinken en activiteiten wanneer ze wakker waren, tot ongeveer dag 40, toen de zware tumorlast, zoals aangetoond door sterke iRFP-fluorescentie op de borst, resulteerde in een merkbare daling van het lichaamsgewicht en het verlies van het normale gedrag. Volgens humane richtlijnen werden de dieren geëuthanaseerd bij 15-20% verlies van lichaamsgewicht. Hoewel de timing van het gewichtsverlies varieerde tussen batches, komt het overeen met het verlies van normaal diergedrag en kan het dus ook worden gebruikt als een betrouwbare indicator van diergezondheid.
De kankerprogressie in het orthotope model van NSCLC werd voornamelijk gevolgd door middel van fluorescerende beeldvorming aan de linker- en ventrale zijde, die een consistente en gestage tumorgroei toonde na MCS-inoculatie. Fluorescentie van de ventrale zijde vertoonde een langzamere toename dan de linkerkant, waarschijnlijk vanwege (1) de diepte van de injectie en (2) de aanwezigheid van zowel orthotope als subcutane tumoren in gevorderde stadia van kanker. In het bijzonder werd het MCS via de ribben in de thorax geïnoculeerd, waardoor het op het dorsale oppervlak van de linkerlong werd afgezet, waardoor het MCS een vertragingstijd nodig had om naar het ventrale oppervlak van de linkerlong te groeien om te worden afgebeeld. Naarmate de tumor groeide, breidde deze zich af en toe uit naar het binnenoppervlak van de borstwand, waardoor deze dichter bij de fluorescerende scanner kwam om hogere signalen te geven voor de beeldvorming aan de linkerkant. Daarom presenteerde fluorescerende beeldvorming aan de ventrale zijde de tumor nauwkeuriger in de long, maar duurde het meestal langer om de tumor te detecteren. Aan het einde van de in vivo fluorescerende beeldvorming werden de dieren geofferd en onderworpen aan open-thoraxdissectie en ex vivo beeldvorming, die niet alleen de vestiging van de orthotope tumor van de MCS-inoculatie bevestigde, maar ook meerdere anatomische kenmerken vertoonde die de vier klinische stadia van NSCLC bij mensen recapituleerden. 
In de pilotstudie naar de werkzaamheid bevestigt de sterke correlatie tussen de ex vivo beeldvorming van de longen en de in vivo beeldvorming van tumordragende muizen de betrouwbaarheid van de dynamische in vivo fluorescentiebeeldvormingsmethodologie. Het orthotope model van NSCLC reageerde betrouwbaar op behandelingen tegen kanker door zowel de langzamere tumorgroei als een belangrijke indicator van therapeutische werkzaamheid als door het verlies van lichaamsgewicht als een belangrijke indicator van geneesmiddeltoxiciteit. Dergelijke antwoorden toonden aan dat het model een waardevol hulpmiddel is voor de preklinische beoordeling en ontwikkeling van kandidaat-geneesmiddelen tegen kanker. Metastase, een kenmerk van longkanker, werd getrouw gerecapituleerd in het model en, nog belangrijker, werd op betrouwbare wijze gehinderd door het antikankermedicijn cisplatine. Langzamere tumorgroei werd waargenomen met slechts twee injecties met cisplatine in deze pilotstudie, wat suggereert dat een significanter antikankereffect van cisplatine het gevolg zou zijn van een meer klinisch relevant regime van vier wekelijkse doses. 
Het orthotope model van NSCLC van dit rapport heeft een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van een aantal gangbare diermodellen van longkanker. Vergeleken met de subcutane xenotransplantaatmodellen van longkanker, biedt dit model een relevantere weefselmicro-omgeving rond de tumoren; Vergeleken met het genetisch gemanipuleerde muismodel biedt dit model handigere experimentele procedures en een reproduceerbaardere tumorprogressie en overleving van dieren. Een uitgebreide vergelijking tussen dit model en andere modellen van longkanker is beschikbaar in onze vorige publicatie18. Net als bij andere diermodellen met xenotransplantaten, is een beperking van dit model het ontbreken van een volledig immuunsysteem, dat een belangrijk onderdeel is van menselijke kankers. Bovendien ontwikkelt het geïnoculeerde MCS in dit model af en toe de primaire xenotransplantaattumor aan de binnenkant van de borstwand. Daarom moeten experimentele procedures om een dergelijke ontwikkeling gemakkelijk te detecteren en te minimaliseren worden opgenomen in toekomstige studies om dit model te verbeteren. Bovendien zullen studies waarbij beide geslachten betrokken zijn, worden uitgevoerd om een beter begrip te krijgen van de tumorbiologie en behandelingsresponsen bij NSCLC. Concluderend staat het orthotopische xenotransplantaatmodel voor longkanker bij muizen van dit rapport als een baanbrekend en robuust hulpmiddel voor het recapituleren van de progressie van longkanker en voor het evalueren van behandelingen tegen kanker. Dit model heeft een enorm potentieel voor het bevorderen van ons begrip van NSCLC-pathologie en voor het ontwikkelen van de bijbehorende therapeutische interventies.

Van alle oncologische aandoeningen veroorzaakt longkanker niet alleen het hoogste verlies aan levens, maar claimt het ook het op één na hoogste aantal nieuwe patiënten per jaar in de VS1. Deze verwoestende maligniteit vormt een groot obstakel in de moderne gezondheidszorg en dringt aan op een dieper begrip van de ingewikkelde biologie en effectievere therapeutische modaliteiten. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is verantwoordelijk voor 85% van de longkanker en heeft de neiging zich te ontwikkelen tot solide tumoren. Een van de belangrijkste uitdagingen bij longkanker is de dynamische en heterogene micro-omgeving van de tumor, die de progressie van de kanker en de reacties op therapeutische interventies diepgaand beïnvloedt 4,5,6. Een beter begrip van de wisselwerking tussen kankercellen en hun micro-omgeving in verschillende stadia van NSCLC vraagt om verfijnde pathologische modellen die de histologische kenmerken van NSCLC-progressie samenvatten.
In dit opzicht komen orthotope diermodellen naar voren als een veelbelovende weg voor NSCLC-onderzoek. In tegenstelling tot algemeen gebruikte subcutane xenotransplantaatmodellen7, bevatten orthotope modellen kankercellen die rechtstreeks in het orgaan van oorsprong worden geïnoculeerd. Voor longkanker betekent dit dat kankercellen rechtstreeks in het longweefsel worden geïmplanteerd 8,9. Bijgevolg bootsen orthotope modellen van longkanker de oorspronkelijke micro-omgeving van de tumor beter na, inclusief de aangrenzende weefsels, bloedvaten en immuuncomponenten, waardoor hun fysiologische en klinische relevantie wordt verbeterd.
Driedimensionale meercellige sferoïden (MCS) vertegenwoordigen een andere veelbelovende benadering voor het recapituleren van kenmerken van de tumoromgeving. De meeste kankers worden gekenmerkt door hun complexe tumormicro-omgeving, waaronder de verschillende cel-celinteracties, de extracellulaire matrix en de gradiënten in zuurstof en voedingsstoffen10,11. Traditionele 2D-celculturen missen de ruimtelijke en structurele complexiteit om deze tumorspecifieke kenmerken samen te vatten12. MCS van de juiste grootte daarentegen heeft een heterogene structuur met een hypoxische en necrotische kern, die niet alleen de intratumorale micro-omgeving recapituleert, maar ook de fysiologische barrière tegen het binnendringen van geneesmiddelen, wat een belangrijk mechanisme is van geneesmiddelresistentie bij antikankertherapie 13,14,15.
Door gebruik te maken van zowel de orthotope diermodellen als de MCS-kweektechnieken, is MCS geënt op immuungecompromitteerde muizen om met succes orthotope modellen van borstkanker en prostaatkanker te construeren16,17. Hierin rapporteren we de gedetailleerde methodologie om een orthotopisch xenotransplantaatmodel van longkanker bij muizen te construeren en te karakteriseren. Deze methode maakt gebruik van de intrapulmonale inoculatie van 3D MCS afgeleid van fluorescerende menselijke longkankercellen (A549-iRFP)18. Dit model biedt een uitzonderlijke mogelijkheid om de in vivo progressie van longkanker te observeren in stadia die nauw parallel lopen met de vier klinische stadia van NSCLC. Bovendien reageerde de xenotransplantaatkanker van dit model op het klinisch vastgestelde medicijn tegen longkanker, cisplatine.

<table><tbody><tr><td>100 &micro;L Glass Syringe</td><td>Hamilton</td><td>Part/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 G Needle</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis Life Sciences&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M Mature Rodent Diet&nbsp;</td><td>Research Diets, Inc.</td><td>D10012M</td><td></td></tr><tr><td>Athymic Nude Mouse</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>Strain Code: 490; homozygoot</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfinehydrochloride</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-nummer: 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>Collageen</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open source tool (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Versie 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-nummer: 17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-nummer: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Keyence</td><td>Modelnummer: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Modelnummer: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy kleindier beeldvormingssysteem&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Modelnummer: 9430</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AAJ67236XF</td><td></td></tr><tr><td>ReViSP software van MATLAB&nbsp;</td><td>Open source tool op Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische clips--AutoClip systeem</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-nummer: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is een zeer dodelijke ziekte met een complexe en heterogene tumormicro-omgeving. Momenteel recapituleren gangbare diermodellen op basis van subcutane inoculatie van suspensies van kankercellen de micro-omgeving van de tumor in NSCLC niet. Hierin beschrijven we een orthotopisch xenotransplantaatmodel voor longkanker bij muizen dat gebruik maakt van de intrapulmonale inoculatie van driedimensionale meercellige sferoïden (MCS). In het bijzonder werden fluorescerende menselijke NSCLC-cellen (A549-iRFP) gedurende 3 weken gekweekt in microplaten met 96 putjes met collageen met een lage hechting om MCS te vormen, die vervolgens intercostaal werden geïnoculeerd in de linkerlong van athymische naaktmuizen om het orthotope longkankermodel vast te stellen.
Vergeleken met de oorspronkelijke A549-cellijn reageerde MCS van de A549-iRFP-cellijn op dezelfde manier op geneesmiddelen tegen kanker. Het fluorescerende signaal met lange golflengte van de A549-iRFP-cellen correleerde sterk met gemeenschappelijke markers van kankercelgroei, waaronder sferoïde volume, cellevensvatbaarheid en cellulair eiwitniveau, waardoor dynamische monitoring van de kankergroei in vivo mogelijk is door fluorescerende beeldvorming. Na inoculatie bij muizen vorderde het A549-iRFP MCS-xenotransplantaat op betrouwbare wijze door fasen die sterk lijken op de klinische stadia van NSCLC, waaronder de uitbreiding van de primaire tumor, het ontstaan van naburige secundaire tumoren en de metastasen van kankercellen naar de contralaterale rechterlong en afgelegen organen. Bovendien reageerde het model op het benchmarkgeneesmiddel tegen longkanker, cisplatine, met de verwachte toxiciteit en langzamere kankerprogressie. Daarom zou dit orthotopische xenotransplantaatmodel van NSCLC bij muizen dienen als een platform om de progressie van de ziekte samen te vatten en de ontwikkeling van potentiële geneesmiddelen tegen kanker te vergemakkelijken.

Karakterisering van A549-iRFP MCS A549-iRFP MCS werden met succes gekweekt in sferoïde microplaten met behulp van collageen en centrifugatie. Wanneer MCS na 1 week een diameter van ongeveer 500 μm bereikte, werden zowel A549 als A549-iRFP MCS gedurende 3 dagen blootgesteld aan een verscheidenheid aan geneesmiddelen en formuleringen tegen kanker en vervolgens gedurende 4 extra dagen in een geneesmiddelvrij groeimedium gehouden. Het A549-iRFP MCS vertoonde een responspatroon dat nauw leek op dat van de moedercellen van de A549. A549 en A549-iRFP MCS vertoonden vergelijkbare dosis-responscurves en IC50-waarden als cisplatine, een van de eerstelijns geneesmiddelen tegen longkanker (Figuur 2A). De levensvatbaarheid van A549 en A549-iRFP MCS werd in vergelijkbare mate geremd door andere geneesmiddelen of formuleringen tegen kanker (Figuur 2B).
De A549-iRFP MCS werden gedurende een periode van maximaal 6 weken gecontroleerd op iRFP-fluorescentie, cellevensvatbaarheid en cellulaire eiwitniveaus. Het volume van MCS werd geschat door softwaresimulatie op basis van de fasecontrastmicroscoopbeelden, en de gesimuleerde morfologie vertoonde vergelijkbare vormen als die afgebeeld door microscoop en fluorescerend signaal (Figuur 2C). De cellevensvatbaarheid van A549-iRFP MCS werd gekwantificeerd door een 3D-cellevensvatbaarheidstest en de test werd gevalideerd met MCS van verschillende groottes met een diameter van 350 tot 950 μm. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen verschillende volumeverhoudingen tussen het groeimedium dat MCS bevat en het testreagens, en tussen verschillende schudtijden van 5 minuten en 10 minuten. (aanvullende figuur S1). Alle vier de biomarkers namen in de loop van de tijd toe, met grotere variaties op latere tijdstippen (Figuur 2D). De iRFP-fluorescentie vertoonde sterke correlaties met de andere drie meer traditionele kwantitatieve metingen van MCS: volume (Pearson r = 0,9307, p < 0,0001), cellevensvatbaarheid (Pearson r = 0,7666, p < 0,0001) en cellulair eiwit (Pearson r = 0,7317, p < 0,0001) (Figuur 2E).
Tumorprogressie bij muizen Na 2-3 weken te hebben gegroeid, werd A549-iRFP MCS met de juiste kenmerken, waaronder morfologie, MCS-diameter, geschikte ruwe randen en fluorescerend signaal (voor gedetailleerde parameters, zie protocolsectie 3), geselecteerd voor tumorinoculatie. Na de tumorinoculatieoperatie werd het lichaamsgewicht van tumordragende muizen elke 3 dagen gemeten en gepresenteerd als de veranderingsverhouding ten opzichte van het gewicht op dag 0 vlak voor de operatie. Het lichaamsgewicht van de muis nam na de operatie iets af en herstelde snel binnen 1 week. Zonder behandeling nam het lichaamsgewicht geleidelijk toe tot ~Dag 40, maar nam drastisch af (~15%) in de volgende week, wat leidde tot de euthanasie (drievoudige overdosis anesthesie: 80 mg/kg ketamine en 12 mg/kg xylazine via IP-injectie) van muizen volgens de IACUC-richtlijnen (Figuur 3A). Tumordragende muizen werden elke 3 dagen afgebeeld in vier houdingen: links, dorsaal, rechts en ventrale zijden. Hiervan werden de linker (waar de tumor wordt geïnoculeerd) en ventrale (waar beide zijden van de longen kunnen worden waargenomen) geselecteerd als sleutelhoudingen voor de kwantificering van de netto fluorescerende intensiteit volgens vergelijking (1) (Figuur 3B,C). De netto fluorescentie-intensiteit van beide houdingen vertoonde een vergelijkbare trend van tumorprogressie, waarbij de fluorescentie van de ventrale zijde iets langzamer groeide dan de linkerkant.
Het MCS-xenotransplantaat in dit orthotopische model doorliep verschillende fasen die de vier klinische stadia van NSCLC weerspiegelen (Figuur 3D)18,19,20. Rond dag 8 na MCS-inoculatie ontstond geconcentreerde fluorescentie in de linkerlong, wat wijst op de vestiging van een gelokaliseerde tumor in lijn met stadium 1 NSCLC in klinische omgevingen. Tegen ongeveer dag 11 was de fluorescentie aanzienlijk geïntensiveerd en/of verspreid over meerdere plaatsen in de linkerlong, wat wijst op de aanwezigheid van tumor(en) die lijken op stadium 2 NSCLC. Vervolgens, rond dag 18, werden verhoogde fluorescerende signalen waargenomen vanaf de ventrale zijde, wat wijst op een stadium 3-achtige progressie van het xenotransplantaat. Bovendien onthulden anatomisch onderzoek en ex vivo beeldvorming tumorgroei op het oppervlak van het hart, een belangrijk kenmerk van stadium 3 NSCLC. Tegen ongeveer dag 27 na MCS-inoculatie verscheen geperfuseerde fluorescentie aan beide zijden van de long en onthulde de anatomie van de open borstkas geperfuseerde tumorgroei in het hart, de luchtpijp en de belangrijkste bloedvaten, wat wijst op uitzaaiing van kanker die lijkt op stadium 4 NSCLC.
Respons van tumordragende muizen op cisplatine Er werd een pilotstudie naar de werkzaamheid uitgevoerd van dit orthotope longkanker-muizenmodel. Tien dagen na inoculatie van de tumor werd 5 mg/kg cisplatine of normale zoutoplossing geïnjecteerd via de staartader van tumordragende muizen, één injectie per week, in totaal twee injecties. De beelden aan de ventrale zijde van tumordragende muizen worden weergegeven in figuur 4A. Het lichaamsgewicht en de fluorescentie van de tumor werden elke 3-4 dagen gecontroleerd. Vergeleken met de normale zoutoplossing verloren de muizen in de cisplatinegroep aanzienlijk lichaamsgewicht na elke cisplatine-injectie, maar herstelden ze in de weken na de behandeling met cisplatine (Figuur 4B). De netto fluorescentie-intensiteit in de cisplatinegroep vertoonde een langzamere trend van toename dan die in de zoutoplossing groep (figuur 4C). Aan het einde van de in vivo fluorescentiemonitoring werden de dieren geofferd en werden hun longen ontleed en in beeld gebracht door middel van fluorescentie. Na normalisatie door het totale weefseleiwit werd bevestigd dat de fluorescerende intensiteit van de longen die werden ontleed van muizen in de cisplatinegroep lager was dan die van de normale zoutoplossinggroep. (Figuur 4E). In de ventrale fluorescerende beeldvorming (Figuur 4A) geven de beelden in de rode rechthoeken de eerste keer aan dat de tumorfluorescentie werd gevisualiseerd in zowel de linker- als de rechterlong, wat een belangrijke indicator is van tumormetastase in stadium IV NSCLC. Cisplatine, een van de eerstelijns geneesmiddelen tegen longkanker, vertraagde de tumormetastase van de linkerlong naar de rechterlong (Figuur 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomschema van het onderzoek. (A) A549-iRFP-cellen zaaien in sferoïde microplaten om MCS te vormen met behulp van collageen en centrifugatie. (B) Intrapulmonale inoculatie van A549-iRFP MCS met de juiste kenmerken in de linkerlong van een muis om het orthotope xenotransplantaatmodel voor longkanker te construeren, dat de vier stadia van longkanker in klinische omgevingen nabootst. De witte spuit met één MCS geeft tumorinoculatie aan, terwijl de twee rode spuiten wijzen op medicamenteuze behandeling die via de staartader wordt toegediend. Afkorting: MCS = meercellige sferoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> Figuur 2: Karakterisering van A549-iRFP MCS. (A) Dosis-responscurves van A549-iRPF MCS en A549 MCS op cisplatine na 3-daagse blootstelling en 4-daagse geneesmiddelvrije groei (gemiddelde ± SD, N = 3-4). (B) Cellevensvatbaarheid van A549-iRFP MCS na 3 dagen blootstelling aan antikankerbehandelingen (cisplatine, paclitaxel of twee in eigen huis ontwikkelde geneesmiddelformuleringen) en 4-daagse geneesmiddelvrije groei (gemiddelde ± SD, N = 3-4). (C) Morfologische studies van representatieve A549-iRFP MCS na 1-6 weken kweken door middel van contrastfasemicroscopie (C1, schaalbalk = 500 μm), fluorescerende confocale microscopie (C2) en softwaresimulatie (C3). (D) Dynamische verandering van de iRFP-fluorescentie, het volume, de cellevensvatbaarheid en het cellulaire eiwit van A549-iRFP MCS gedurende 1-6 weken (N = 10 voor iRFP-fluorescentie en volume; N = 5 voor de levensvatbaarheid van de cellen en het cellulaire eiwit). (E) Correlatie van iRFP-fluorescentie van A549-iRFP MCS met de andere drie traditionele groeimetingen (volume, cellevensvatbaarheid en cellulair eiwit) gedurende 1-6 weken (N = 60). (F) Een voorbeeld van A549-iRFP MCS van geschikte kenmerken voor tumorinoculatie (schaalbalk = 500 μm). Afkorting: MCS = meercellige sferoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> Figuur 3: Tumorprogressie in het orthotope muizenmodel van NSCLC. (A) Verandering in lichaamsgewicht van muizen na inoculatie van de tumor (gemiddelde ± SEM, N = 5). (B) Dynamische verandering van netto fluorescerende intensiteit bij tumordragende muizen op basis van beeldvorming aan de linkerkant (N = 5). (C) Dynamische verandering van netto fluorescerende intensiteit bij tumordragende muizen op basis van beeldvorming aan de ventrale zijde (N = 5). (D) Kankerprogressie die de vier klinische stadia van NSCLC nabootst. Beeldvorming aan de linkerkant, beeldvorming aan de ventrale zijde, anatomische observatie (gele pijlen geven tumoren in de long en op het hartoppervlak aan) en ex-vivo beeldvorming van representatieve tumordragende muizen in vier stadia. Dit cijfer is ontleend aan Huang et al.18. Afkorting: NSCLC = niet-kleincellige longkanker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> Figuur 4: Reactie van tumordragende muizen op cisplatine. (A) Beeldvorming aan de ventrale zijde van tumordragende muizen na behandeling met zoutoplossing of cisplatine (afbeeldingen in rode rechthoeken geven aan wanneer de tumorfluorescentie voor het eerst kan worden gevisualiseerd in zowel de linker- als de rechterlong). (B) Verandering in het lichaamsgewicht van tumordragende muizen na behandelingen met zoutoplossing of cisplatine (gemiddelde ± SEM, N = 3-4). (C) Dynamische verandering van netto fluorescerende intensiteit bij tumordragende muizen na behandelingen met zoutoplossing of cisplatine op basis van beeldvorming aan de ventrale zijde (gemiddelde ± SEM, N = 3-4). (D) Percentage muizen dat tumorfluorescentie vertoont op zowel de linker- als de rechterlong. (E) Genormaliseerde fluorescerende intensiteit van longen ontleed van muizen die zijn geofferd aan het einde van in vivo fluorescerende beeldvorming (gemiddelde ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: 3D-cel levensvatbaarheidstest op A549-iRFP MCS van verschillende diameters. (A) ~350 μm; (B) ~550 μm; (C) ~750 μm; (D) ~950 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Deze studie presenteert een orthotopisch model voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC) op basis van intrapulmonale inoculatie van meercellige sferoïden van fluorescerende A549-iRFP-cellen. Het model recapituleert klinische NSCLC-stadia en reageert op cisplatine, volgens dynamische in vivo monitoring van fluorescentie met lange golflengten.

Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit manuscript beschrijft een methode die wordt gebruikt om xenografts (PDX's) van prostaatkankerpatiënten te genereren vanuit circulerende tumorcellen (CTC's). Het genereren van PDX-modellen uit CTC's biedt een alternatief experimenteel model om prostaatkanker te bestuderen; de meest vaak gediagnosticeerde tumor en een frequente doodsoorzaak door kanker bij mannen.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

Prostaatkanker is de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Een orthotopisch kankermodel biedt een nuttige benadering om de biologie van prostaatkanker te begrijpen en de werkzaamheid van therapeutische regimes te evalueren. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen die nodig zijn om een orthotopisch muismodel voor prostaatkanker te vestigen.

Pre-klinische Orthotope muizenmodel van Human prostaatkanker

Gebruik makend van de patiënt afgeleide tumoren in een subcutane preklinisch model is een uitstekende manier om de effectiviteit van nieuwe therapieën, voorspellende ontdekking van biomarkers, en resistente paden te bestuderen. Dit model, in de ontwikkeling van geneesmiddelen, is essentieel voor het bepalen van het lot van vele nieuwe anti-kankerbehandelingen voorafgaand aan klinisch onderzoek.

Ontwikkeling en onderhoud van een preklinisch Patient Afgeleid Tumor xenograft model voor onderzoek naar nieuwe anti-Cancer Therapies

Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.

Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Hier beschrijven we een minimaal invasieve syngeneic orthotopic transplantatie model van muis Long adenocarcinoom cellen als een tijd - en kostenbesparende model om te studeren niet-kleincellige longkanker.

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Het huidige protocol stelt een patiënt-afgeleid xenograft (PDX) model van anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) en hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) vast en karakteriseert het, aangezien PDX-modellen snel de standaard worden op het gebied van translationele oncologie.

Vaststelling en karakterisering van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van anaplastisch schildkliercarcinoom en hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Een grote uitdaging bij het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor longkanker is het modelleren van de micro-omgeving van de tumor naarmate de regionale ziekte evolueert naar gemetastaseerde ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om een orthotopisch syngeen model van longkanker op te stellen dat het mogelijk maakt om in vivo de ziekte in de loop van de tijd te volgen.

Een minimaal invasieve methode voor het genereren van een syngeen orthotopisch muismodel van longkanker

Leer een orthotopisch NSCLC-xenotransplantaatmodel opzetten met meercellige sferoïden van fluorescerende A549-iRFP-cellen. Deze methode bootst klinische ziektestadia na en voorspelt cisplatine-respons via dynamische in vivo beeldvorming.

Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt (Video) | JoVE Journal

Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt

Meer video's verkennen