Name: Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Ontdek hoe je 3D organoïden kweekt uit menselijk ovarieel oppervlakte-epitheel voor onderzoek naar weefselregeneratie. Deze methode biedt een waardevol platform voor reproductieve gezondheidsstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen alle patiënten bedanken die weefsel hebben gedoneerd voor deze studie, de leden van de Chuva de Sousa Lopes-groep voor nuttige discussies, en I. De Poorter voor het ontwerpen van de cartoons die in figuur 1 zijn gebruikt. Dit onderzoek werd gefinancierd door de European Research Council, subsidienummer ERC-CoG-2016- 725722 (OVOGROWTH) voor J.S.D.V. en S.M.C.d.S.L.; en de Novo Nordisk Foundation (reNEW), subsidienummer NNF21CC0073729 voor J.S.D.V. en S.M.C.d.S.L.

Het onderzoek werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. De onderzoeksopzet is voorgelegd aan de Medisch Ethische Commissie van het Leids Universitair Medisch Centrum (LUMC) en voorafgaand aan het onderzoek is een verklaring van geen bezwaar (B18.029) verkregen. Primair menselijk eierstokweefsel dat werd gebruikt, werd verzameld van transmasculiene mensen die een genderbevestigende operatie ondergingen in het VUmc-ziekenhuis (Amsterdam, Nederland). Van alle donoren werd ondertekende geïnformeerde toestemming verkregen. Alle materialen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Isolatie van menselijke primaire OSE-cellen
<ol><li>Plaats na ovariëctomie de eierstokken in 0,9% NaCl of een vergelijkbare steriele zoutoplossing en transporteer deze op ijs naar het laboratorium.</li>
	<li>Breng individuele eierstokken over in een conische buis van 50 ml met 2-3 ml spijsverteringsmedium (tabel 1) of voldoende om de eierstok te bedekken. LET OP: Als de eierstok niet intact is (een deel van het orgaan is afgesneden voor histologische analyse), is het van cruciaal belang om dit deel niet te bedekken met het spijsverteringsmedium.</li>
	<li>Plaats de tube in een voorverwarmd parelbad (of waterbad) op 37 °C gedurende 30 min.</li>
	<li>Breng de eierstok voorzichtig over in een petrischaal van 60 mm met 10 ml afnamemedium (tabel 1).</li>
	<li>Schraap het eierstokoppervlak met de hOSE-cellen voorzichtig af met behulp van een celschraper. Was de schraper in het medium en herhaal deze stap minstens drie keer (Figuur 1). LET OP: Als de eierstok niet intact is, vermijd dan zowel schrapen als onderdompelen van het beschadigde gebied om besmetting met ongewenste celtypen te minimaliseren.</li>
	<li>Breng de hOSE-cellen in het verzamelmedium over in een buisje van 15 ml.</li>
	<li>Draai hOSE-cellen af op 240 x g gedurende 5 minuten.<ol><li>Als de pellet een rode kleur vertoont, wat wijst op besmetting met rode bloedcellen (RBC), resuspendeer de pellet dan met 1 ml RBC-lysisbuffer. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT) met af en toe pipetteren, voeg 4 ml PBS met calcium en magnesium (PBS+/+) toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 240 x g . Als RBC aanhoudt, herhaalt u deze stap.</li>
	</ol></li>
	<li>Cryopreservatie van de hOSE-celpellet (sectie 2), gebruik deze voor 2D-cultuur (sectie 3) of 3D-organoïden (sectie 4) (Figuur 1).</li>
</ol>2. Cryopreservatie-ontdooien van hOSE-cellen
<ol><li>Cryopreservatie<ol><li>Resuspendeer de hOSE-celpellet in 1 ml celvriesmedia.</li>
		<li>Breng de celsuspensie over naar cryovials (2x cryovials per eierstok).</li>
		<li>Plaats de cryovials in een vriescontainer en plaats deze een nacht bij -80 °C.</li>
		<li>Breng de ingevroren cryovials over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontdooien:<ol><li>Haal de cryovial uit de vloeibare stikstof.</li>
		<li>Plaats de cryovial in een voorverwarmd parelbad (of waterbad) op 37 °C gedurende 5 minuten of totdat er slechts een kleine bevroren kern zichtbaar is in de cryovial.</li>
		<li>Pipiteer de hOSE-celsuspensie in een buisje van 15 ml met 10 ml verzamelmedium (tabel 1).</li>
		<li>Centrifugeer op 240 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Gebruik de hOSE-celpellet voor 2D-cultuur (sectie 3) of 3D-organoïden (sectie 4).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 2D hOSE-cultuur in monolaag
<ol><li>Resuspendeer de hOSE-pellet in 1 ml OSE_2D medium (tabel 1) en breng het over in een putje van een plaat met 12 putjes.</li>
	<li>Voeg 1 ml extra van OSE_2D medium toe aan het putje en kweek bij 37 °C in een bevochtigde incubator (5% CO2) gedurende 72 uur om ervoor te zorgen dat de hOSE-cellen hechten voordat het medium voor het eerst wordt verwisseld.</li>
	<li>Ververs de media elke 2-3 dagen totdat de hOSE-cellen 70%-90% confluentie (P0) bereiken (Figuur 2A). OPMERKING: Als er nog steeds rode bloedcellen in de cultuur aanwezig zijn, worden ze verwijderd tijdens de eerste mediawissel en blijven alleen de hOSE-cellen aan het putje vastzitten.</li>
	<li>Volg de onderstaande stappen voor het passeren van hOSE-cellen.<ol><li>Haal cultuurmedia uit de put.</li>
		<li>Wassen met 1 ml steriele PBS.</li>
		<li>Verwijder PBS en voeg voldoende 0,05% trypsine/EDTA toe om de cellen te bedekken.</li>
		<li>Plaats de plaat bij 37 °C in een bevochtigde incubator (5% CO2) gedurende 4-7 minuten totdat u merkt dat de cellen zich afronden en loskomen van de put.</li>
		<li>Stop de enzymatische reactie door 1 ml opvangmedium toe te voegen.</li>
		<li>Verzamel de hOSE-cellen en centrifugeer op 240 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Zaadcellen in een nieuw putje met de gewenste dichtheid, ververs de media elke 2-3 dagen totdat hOSE-cellen 70%-90% confluentie bereiken en herhaal stap 3.4. OPMERKING: Primaire hOSE-cellen kunnen tot drie passages worden gekweekt. Daarna zullen de meeste cellen senescent worden (Figuur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik de geëxpandeerde hOSE-cellen voor verdere karakterisering met behulp van immunofluorescentie (Figuur 2B) om de effecten van kweekmedia te testen (Figuur 2C) of voor 3D-organoïden (Sectie 4).</li>
</ol>4. 3D hOSE-organoïdecultuur
<ol><li>Voorwarm de objectglaasje met meerdere putkamers op 37 °C.</li>
	<li>Tel (vers geïsoleerde of gecryopreserveerde-ontdooide) hOSE-cellen met een geautomatiseerde celteller of handmatig met een hemocytometer.</li>
	<li>Resuspendeer het gewenste aantal hOSE-cellen tot 1 ml ijskoud OSE-organoïde basismedium (tabel 1) in een buisje van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer op 240 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspendeer de hOSE-pellet in de gewenste hoeveelheid ijskoude onverdunde basaalmembraanextract (BME)-oplossing om een celconcentratie van 1 x 104 cellen/10 μL BME te verkrijgen.</li>
	<li>Pipetteer de hOSE-BME-oplossing op en neer om een homogene verdeling te garanderen.</li>
	<li>Maak 10 μl druppeltjes hOSE-BME-oplossing per putje in het voorverwarmde objectglaasje met meerdere putjes. NOTITIE: Zorg ervoor dat elke druppel zich in het midden van de put bevindt om een druppelvorm te verkrijgen.</li>
	<li>Plaats de plaat met de druppels ondersteboven bij 37 °C gedurende 15 minuten in een bevochtigde incubator (5% CO2) om de gel te laten stollen.</li>
	<li>Voeg 100 μL OSE_3D medium toe (tabel 1) en kweek bij 37 °C in een bevochtigde incubator (5% CO2).</li>
	<li>Ververs het medium elke 3-4 dagen. OPMERKING: hOSE-organoïden blijven minstens tot 28 dagen in cultuur groeien (Figuur 3A, B), maar elke 14-28 dagen passeren (groeisnelheid is afhankelijk van donor, vers versus cryo hOSE) wordt geadviseerd om celproliferatie en overleving van organoïden te stimuleren. Drie onafhankelijke hOSE-organoïde lijnen werden minstens 4 keer gepasseerd zonder tekenen van veroudering. hOSE-organoïden vertonen verschillende morfologieën (Figuur 3C).</li>
	<li>Voor het passeren van hOSE-organoïden:<ol><li>Verwijder het medium en voeg 100 μL ijskoude geavanceerde DMEM/F12 toe aan elk putje.</li>
		<li>Schraap de bodem van de putjes af met een P1000 pipetpunt om de geldruppels los te maken.</li>
		<li>Breng elke drijvende geldruppel over in een buisje van 1,5 ml.</li>
		<li>Centrifugeer de buisjes met de geldruppels op 240 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 300 μL celdissociatiebuffer en plaats de buisjes in een voorverwarmd parelbad (of waterbad) bij 37 °C gedurende 5-10 min. OPMERKING: Als sommige organoïden intact blijven, pipetteer dan een paar keer op en neer met de punt van de foetale runderserum bedekte, ijskoude pipet om ze mechanisch te verstoren. Het coaten van pipetpunten met foetaal runderserum voorkomt dat de organoïden aan de punt blijven plakken.</li>
		<li>Voeg 300 μL hOSE-organoïde basismedium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 240 x g .</li>
		<li>Resuspendeer de pellet in de gewenste hoeveelheid onverdunde BME-oplossing, zaai ze opnieuw in een geschikte verhouding (verdeel de inhoud van 1 druppel over 1-4 druppels) en kweek zoals hierboven vermeld. OPMERKING: De organoïden worden niet gedissocieerd in afzonderlijke cellen en daarom kunnen de cellen niet nauwkeurig worden geteld voor verdere passage.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Immunofluorescentie van 3D hOSE-organoïden
OPMERKING: Immunofluorescentie van het geheel kan worden uitgevoerd in hetzelfde kweekputje (in de druppel) als gebruik wordt gemaakt van objectglaasjes met meerdere putkamers die geschikt zijn voor microscopietechnieken.
<ol><li>Fixeer de hOSE-organoïden in de druppels in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij RT.</li>
	<li>Was twee keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT op een roterend/schuddend platform.</li>
	<li>Permeabiliseer de hOSE-organoïden in de druppeltjes met behulp van 100 μL permeabilisatiebuffer (tabel 1) gedurende 15 minuten bij RT.</li>
	<li>Was driemaal met 100 μL blokkeerbuffer (tabel 1) gedurende 15 minuten bij RT en blokkeer 's nachts (o/n) bij 4 °C op een roterend/schuddend platform.</li>
	<li>Incubeer met 100 μL primair antilichaammengsel verdund in blokkeerbuffer bij 4 °C o/n op een roterend/schuddend platform. OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor een lijst van primaire antilichamen die zijn gebruikt, het gemarkeerde celtype en het diermodel dat is gebruikt om expressie 12,19,20,21,22,23,24,25 te valideren.</li>
	<li>Breng de plaat naar RT en was deze drie keer met 100 μL blokkeerbuffer gedurende 15 minuten bij RT op een draaiend/schuddend platform.</li>
	<li>Incubeer met 100 μL secundair antilichaammengsel verdund in blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij RT op een roterend/schuddend platform, maar beschermd tegen licht. OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor een lijst van gebruikte secundaire antilichamen. Ter bescherming tegen licht, plaatst u het bord in een donkere doos of dekt u het af met aluminiumfolie.</li>
	<li>Was drie keer in 100 μL PBS gedurende 15 minuten bij RT op een roterend/schuddend platform.</li>
	<li>Bewaar de plaat bij 4 °C, afgedekt met aluminiumfolie, tot de beeldvorming (Figuur 4).</li>
</ol>6. Kwantificering van de grootte van de hOSE-organoïde
<ol><li>Maak 10x helderveldfoto's (TIFF-beeld) op een microscoop.</li>
	<li>Download en installeer Fiji (https://imagej.net/software/fiji/)26.</li>
	<li>Meet het beeldgebied van hOSE-organoïden met ImageJ-software Fiji:<ol><li>Laad afbeeldings-TIFF-bestanden in Fiji.</li>
		<li>Maak een drempel voor de software om de hOSE-organoïden (donkerder gebied) in de geüploade helderveldafbeelding te herkennen door op Afbeelding te klikken > > drempel aanpassen. Pas de waarden onder en boven aan totdat het grootste deel van de achtergrond is verwijderd en individuele organoïden behouden blijven.</li>
		<li>Open de ROI-tool door te klikken op Analyze > Tool > ROI.</li>
		<li>Selecteer het gereedschap Toverstaf en klik op het gebied met een hOSE-organoïde totdat u een gele lijn ziet die de hele omtrek van de organoïde omringt. Klik in het ROI-paneel op Toevoegen en meten om de oppervlaktewaarde van die OSE-organoïde te verkrijgen.</li>
		<li>Herhaal stap 6.3.4. voor elke hOSE-organoïde die moet worden gemeten.</li>
	</ol></li>
</ol>

Menselijke ovariële epitheelorganoïden: een model voor weefselherstel en het testen van geneesmiddelen

<ol><li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+and+fimbrial+stem+cells%3A+biology%2C+niche+and+cancer+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (10), 625-638 (2015).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22 (2), 255-288 (2001).</li>
<li>Tan, O. L., Fleming, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+cell+nuclear+antigen+immunoreactivity+in+the+ovarian+surface+epithelium+of+mice+of+varying+ages+and+total+lifetime+ovulation+number+following+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity in the ovarian surface epithelium of mice of varying ages and total lifetime ovulation number following ovulation.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1501-1507 (2004).</li>
<li>Carter, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+heterogeneity+of+stemness+phenotypes+in+the+ovarian+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional heterogeneity of stemness phenotypes in the ovarian epithelium.</a> Commun Biol. 4 (1), 527(2021).</li>
<li>Chumduri, C., Turco, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Organoids of the female reproductive tract.</a> J Mol Med (Berl). 99 (4), 531-553 (2021).</li>
<li>Edmondson, R. J., Monaghan, J. M., Davies, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ovarian+surface+epithelium+is+an+androgen+responsive+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The human ovarian surface epithelium is an androgen responsive tissue.</a> Br J Cancer. 86 (6), 879-885 (2002).</li>
<li>Karlan, B. Y., Jones, J., Greenwald, M., Lagasse, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+effects+on+the+proliferation+of+human+ovarian+surface+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone effects on the proliferation of human ovarian surface epithelium in vitro.</a> Am J Obstet Gynecol. 173 (1), 97-104 (1995).</li>
<li>Nakamura, M., Katabuchi, H., Ohba, T., Fukumatsu, Y., Okamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+characteristics+of+human+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and characteristics of human ovarian surface epithelium.</a> Virchows Arch. 424 (1), 59-67 (1994).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Del Valle, J. S., Chuva de Sousa Lopes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+ovarian+models+as+paramount+technology+for+female+health+management+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D ovarian models as paramount technology for female health management and reproduction.</a> Bioengineering (Basel). 10 (7), 832(2023).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121.e7 (2023).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nat Commun. 11 (1), 2660(2020).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fallopian+tube+and+ovarian+surface+epithelium+are+cells-of-origin+for+high-grade+serous+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Both fallopian tube and ovarian surface epithelium are cells-of-origin for high-grade serous ovarian carcinoma.</a> Nat Commun. 10 (1), 5367(2019).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Abedini, A., Sayed, C., Carter, L. E., Boerboom, D., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+WNT5a+regulates+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Non-canonical WNT5a regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Sci Rep. 10 (1), 9695(2020).</li>
<li>Bowen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+supports+the+hypothesis+that+human+ovarian+surface+epithelia+are+multipotent+and+capable+of+serving+as+ovarian+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling supports the hypothesis that human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian cancer-initiating cells.</a> BMC Med Genomics. 2, 71(2009).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+switch+for+the+orientation+of+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization.</a> Dev Cell. 31 (2), 171-187 (2014).</li>
<li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495 (7440), 241-245 (2013).</li>
<li>Hosper, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+in+fibrosis%3A+collagen+type+I+expression+is+highly+upregulated+after+EMT%2C+but+does+not+contribute+to+collagen+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition in fibrosis: collagen type I expression is highly upregulated after EMT, but does not contribute to collagen deposition.</a> Exp Cell Res. 319 (19), 3000-3009 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+YAP+activation+in+Procr+cells+is+essential+for+ovarian+stem%2Fprogenitor+expansion+and+epithelium+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Selective YAP activation in Procr cells is essential for ovarian stem/progenitor expansion and epithelium repair.</a> Elife. 11, e75449(2022).</li>
<li>Wong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+conditional+cadherin+expression+in+cultured+human+ovarian+surface+epithelium%3A+influence+of+family+history+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Constitutive and conditional cadherin expression in cultured human ovarian surface epithelium: influence of family history of ovarian cancer.</a> Int J Cancer. 81 (2), 180-188 (1999).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+ovarian+surface+epithelial+cells+and+ascites-derived+ovarian+cancer+cells+from+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).</li>
<li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Res. 19 (2), 156-172 (2009).</li>
<li>Miettinen, P. J., Ebner, R., Lopez, A. R., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells%3A+involvement+of+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> J Cell Biol. 127 (6 Pt 2), 2021-2036 (1994).</li>
<li>Danielpour, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+enzyme-linked+immunosorbent+assays+%28SELISAs%29+quantitate+and+distinguish+two+forms+of+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta+1+and+TGF-beta+2%29+in+complex+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (SELISAs) quantitate and distinguish two forms of transforming growth factor-beta (TGF-beta 1 and TGF-beta 2) in complex biological fluids.</a> Growth Factors. 2 (1), 61-71 (1989).</li>
<li>Oida, T., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+TGF-beta+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Depletion of TGF-beta from fetal bovine serum.</a> J Immunol Methods. 362 (1-2), 195-198 (2010).</li>
<li>Halder, S. K., Beauchamp, R. D., Datta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+inhibitor+of+TGF-beta+receptor+kinase%2C+SB-431542%2C+as+a+potent+antitumor+agent+for+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers.</a> Neoplasia. 7 (5), 509-521 (2005).</li>
<li>Wang, J., Wang, D., Chu, K., Li, W., Zeng, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procr-expressing+progenitor+cells+are+responsible+for+murine+ovulatory+rupture+repair+of+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Procr-expressing progenitor cells are responsible for murine ovulatory rupture repair of ovarian surface epithelium.</a> Nat Commun. 10 (1), 4966(2019).</li>
<li>Kawata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+switching+of+ovarian+cancer+cell+clusters+via+SRC+family+kinase+is+involved+in+the+peritoneal+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Polarity switching of ovarian cancer cell clusters via SRC family kinase is involved in the peritoneal dissemination.</a> Cancer Sci. 113 (10), 3437-3448 (2022).</li>
<li>Davies, B. R., Worsley, S. D., Ponder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+E-cadherin%2C+alpha-catenin+and+beta-catenin+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin in normal ovarian surface epithelium and epithelial ovarian cancers.</a> Histopathology. 32 (1), 69-80 (1998).</li>
<li>Skory, R. M., Xu, Y., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+ovarian+cycle+using+in+vitro+follicle+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Engineering the ovarian cycle using in vitro follicle culture.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1386-1395 (2015).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+endometrial+disease+capture+clinical+heterogeneity+and+are+amenable+to+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening.</a> Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).</li>
<li>Phan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+high-throughput+approach+identifies+actionable+drug+sensitivities+in+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids.</a> Commun Biol. 2, 78(2019).</li>
<li>Ducie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+high-grade+serous+ovarian+carcinoma+with+and+without+associated+serous+tubal+intra-epithelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of high-grade serous ovarian carcinoma with and without associated serous tubal intra-epithelial carcinoma.</a> Nat Commun. 8 (1), 990(2017).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> J Pathol. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Curr Protoc Cell Biol. 83 (1), e82(2019).</li>
<li>Asseler, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-third+of+amenorrheic+transmasculine+people+on+testosterone+ovulate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">One-third of amenorrheic transmasculine people on testosterone ovulate.</a> Cell Rep Med. 5 (3), 101440(2024).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+androgen+exposure+in+female-to-male+transsexual+persons+of+reproductive+age+induces+hyperplasia+of+the+ovarian+cortex+and+stroma+but+not+polycystic+ovary+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Excessive androgen exposure in female-to-male transsexual persons of reproductive age induces hyperplasia of the ovarian cortex and stroma but not polycystic ovary morphology.</a> Hum Reprod. 28 (2), 453-461 (2013).</li>
<li>De Roo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture+profile+analysis+reveals+a+stiffer+ovarian+cortex+after+testosterone+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Texture profile analysis reveals a stiffer ovarian cortex after testosterone therapy: a pilot study.</a> J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1837-1843 (2019).</li>
<li>Grimstad, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+histopathology+in+transmasculine+persons+on+testosterone%3A+A+multicenter+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sex+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian histopathology in transmasculine persons on testosterone: A multicenter case series.</a> J Sex Med. 17 (9), 1807-1818 (2020).</li>
</ol>

3D-organoïdetechnologie is in opkomst als een onmisbaar hulpmiddel voor medisch onderzoek. Aan de ene kant biedt dit in vitro platform de mogelijkheid om fundamentele mechanistische vragen over weefselregeneratie, wondgenezing en ontwikkeling tebestuderen18. Aan de andere kant maken 3D-organoïden afgeleid van patiëntmonsters gepersonaliseerde geneeskundestudies mogelijk, waaronder diagnostiek, medicijntesten en celtherapie 12,13,14,37,38. Op het gebied van ovarieel onderzoek heeft de hOSE aanzienlijke belangstelling gekregen sinds de implicatie ervan als de oorsprong van epitheliale ovariumcarcinomen39. Hoewel wordt gedacht dat het meeste hooggradige sereus ovariumcarcinoom (HGSOC), een van de meest voorkomende epitheliale eierstokkankers, voortkomt uit de eileiders40, heeft huidig onderzoek naar 3D-eierstokorganoïden van muizen een mogelijke dubbele oorsprong van HGSOC van OSE en eileider 15,16 voorgesteld.
Hier beschreven we een protocol voor de afleiding van hOSE 3D-organoïden en schetsten we de toepassing ervan om nieuwe mechanistische kennis te brengen in de regeneratie van eierstokweefsel. Dit protocol omvat een stapsgewijze methode om primaire hOSE-cellen uit menselijke eierstokken te isoleren en 3D hOSE-organoïden te genereren. Om een efficiënte hOSE-organoïdeafleiding te garanderen, is het van cruciaal belang om ovariële manipulatie tot een minimum te beperken. Vanwege zijn locatie op het ovariumoppervlak en de monolaagorganisatie is de hOSE vatbaar voor schade en verlies tijdens ovariëctomie en orgaanmanipulatie. Om deze reden hebben we de voorkeur gegeven aan een enzymatische en schraapmethode die op de hele eierstok wordt toegepast om hOSE 2,8 te isoleren. In het huidige protocol werd een milde enzymatische behandeling toegepast om de hOSE-intercellulaire verbindingen te verstoren, gevolgd door zacht schrapen van het eierstokoppervlak.
Bij het vergelijken van 2D met 3D hOSE-cultuur, is het belangrijk op te merken dat, ondanks de aanvankelijke hoge proliferatiesnelheid van hOSE-cellen in 2D-cultuur, hun cellulaire kenmerken veranderden als gevolg van EMT, wat suggereert dat de toegepaste 2D-cultuuromstandigheden niet geschikt zijn om een epitheliale morfologie te behouden. Daarentegen kunnen 3D hOSE-organoïden minstens 4 keer worden gepasseerd zonder tekenen van veroudering. De OSE_3D gebruikte organoïde kweekmedia was gebaseerd op die van Kopper en collega's voor de afleiding van OC en gezonde hOSE-organoïden12 en van Kessler en collega's voor de afleiding van menselijke FT-organoïden17. Het belangrijkste verschil was de vervanging van menselijke Wnt3a- en R-Spondin-1-geconditioneerde media door in de handel verkrijgbare recombinante eiwitten om de reproduceerbaarheid te vergemakkelijken.
Immunofluorescentietechnieken omvatten meestal het verwijderen van het weefselmonster van de kweekplaat en het verwerken voor paraffine- of cryosectie. Bij het werken met zeer kleine structuren is het risico groot dat ze tijdens de monsterverwerking verloren gaan. In dit protocol vindt de afleiding van hOSE-organoïden plaats in celkweekplaten die directe microscopiebeeldvorming mogelijk maken zonder dat de hOSE-organoïden uit de BME-matrix hoeven te worden verwijderd. Bovendien maakte de hier gebruikte immunofluorescentiemethode voor de hele montage, beschreven door Rezanejad en collega's voor ductale organoïden van de pancreas41, in situ observatie van eiwitlokalisatie binnen morfologisch intacte organoïden mogelijk. We hebben aangetoond dat, bij het uitvoeren van dit immunofluorescentieprotocol op hOSE-organoïden die zijn afgeleid in objectglaasjes met meerdere putkamers, er een zeer efficiënte antilichaampenetratie is met een zeer laag achtergrondsignaal.
Hoewel de meeste hOSE-organoïden die met deze methode werden afgeleid, geen CDH1-expressie hadden, vormden sommige CDH1+ hOSE-organoïden, die grotere afmetingen bereikten in vergelijking met CDH1-hOSE-organoïden. De expressie van CDH1 is in verband gebracht met neoplastische hOSE-fenotypes 2,35. De eierstokken die werden gebruikt voor hOSE-isolatie werden gedoneerd door gezonde transmasculiene donoren in de vruchtbare leeftijd (27,1 ± 5 jaar oud). Deze donoren ondergingen een testosteronbehandeling gedurende een periode van 38 ± 15 maanden voorafgaand aan ovariëctomie. We kunnen de mogelijkheid niet negeren dat de CDH1+ hOSE-cellen op het eierstokoppervlak kunnen worden toegeschreven aan de testosteronbehandeling. Hoewel androgeenbehandeling in verband is gebracht met veranderingen in de eierstokken, zoals anovulatie42, hyperplasie van het corticale gebied43 en verhoogde corticale stijfheid44, blijft de algemene ovariële pathologie goedaardig bij gebruik van testosteron45.
Samenvattend benadrukt dit protocol het potentieel van het genereren van hOSE 3D-organoïden om mechanistische vragen over de regeneratie van eierstokweefsel te decoderen. Belangrijk is dat deze methode ook kan worden toegepast voor de detectie van kwaadaardige cellen die aanwezig zijn in ovariumbiopten van patiënten met een risico op de ontwikkeling van kanker. Gezamenlijk ondersteunt deze methode mogelijke toepassingen van dit innovatieve in vitro platform voor zowel fundamentele ovariële functiestudies als klinische toepassingen voor geïndividualiseerde medische behandelingen.

De eierstok wordt beschouwd als een van de meest dynamische organen in het lichaam en ondergaat constante cycli van wondgenezing en hermodellering gedurende de reproductieve levensduur van het individu. Een belangrijke speler die betrokken is bij de regeneratie van eierstokweefsel na elke ovulatiecyclus is het ovariumoppervlakte-epitheel (OSE)1. De OSE is een van mesotheel afgeleide enkele laag met platte, kubusvormige en zuilvormige epitheelcellen die het gehele eierstokoppervlak bedekken2. Voorafgaand aan de eisprong ondergaat het stromale weefsel van de eierstokken op het oppervlak van de ovulatoire follikel een proteolytische verstoring om de afgifte van het cumulus-eicelcomplex mogelijk te maken. Het gewonde gebied, bekend als het ovulatoire stigma, wordt vervolgens gerepareerd, waarbij bij muizen volledige sluiting van het ovariumoppervlak in minder dan 72 uur wordt bereikt3. Het zeer efficiënte vermogen van de OSE om zich te vermenigvuldigen en de ovulatiewond te sluiten, benadrukt het vermeende bestaan van een inwonende stamcelpopulatie4. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van menselijke eierstokken van donoren in de vruchtbare leeftijd, is de meeste kennis over de mechanismen van OSE-herstel afkomstig van diermodellen. Soortspecifieke kenmerken belemmeren echter de vertaling van dierlijk ovariumonderzoek naar de mens5.
In vitro-studies is voornamelijk gebruik gemaakt van 2-dimensionale (2D) celcultuur van humaan OSE, waarbij cellen groeiden in een monolaag die aan het oppervlak van een kweekplaat was bevestigd, vanwege de kosteneffectiviteit en gemakkelijke kweek 6,7,8. Desalniettemin heeft deze benadering beperkingen die de complexiteit van de dynamiek van het eierstokweefsel repliceren9. In dit opzicht hebben 3D-celkweekplatforms met een speciale focus op eierstokorganoïden een revolutie teweeggebracht in het onderzoek naar eierstokken10. Weefselorganoïden zijn geminiaturiseerde in vitro representaties van het orgaan waarvan ze zijn afgeleid, vertonen 3D-zelforganisatiecapaciteit en bootsen de belangrijkste functies en structuren van hun in vivo tegenhangers na11. Deze technologie biedt de mogelijkheid om licht te werpen op fundamentele vragen met betrekking tot ontwikkeling, regeneratie en weefselherstel in de menselijke eierstok10. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers ook kennis over eierstokorganoïden toegepast voor het genereren van patiëntspecifieke eierstokkanker (OC) organoïden voor ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde 12,13,14.
Op basis van verschillende methoden die worden gebruikt voor het genereren van OSE-organoïden van muizen en organoïden van eileiders (FT)15,16 en van menselijke OSE-organoïden12 en FT-organoïden17, beschrijven we hier een protocol voor het afleiden van menselijke OSE-organoïden uit menselijke eierstokken met mogelijke toepassingen in OSE-regeneratiestudies. Dit protocol isoleert op efficiënte wijze primaire OSE-cellen uit hele menselijke eierstokken en bevat een stapsgewijze beschrijving van 2D-celexpansie en 3D hOSE-organoïdegeneratie. De hOSE-organoïden vertoonden (donorspecifieke) variabiliteit in morfologie en groei, wat hun bruikbaarheid voor gepersonaliseerde studies benadrukte. Bovendien omvat dit protocol onderhoud, passaging en immunofluorescentie van hOSE-organoïden binnen dezelfde kweekplaat. Bovendien geeft het een beschrijving van de verschillende morfologie die hOSE-organoïden kunnen aannemen en karakteriseert het veranderingen in het immunofenotype tijdens de kweek. Ten slotte toont het nut aan door de invloed van omgevingssignalen, zoals eierstokhormonen, op de vorming en groei van hOSE-organoïden te onderzoeken op basis van het aantal en de grootte van hOSE-organoïden.
De toepassing van hOSE-organoïdetechnologie zal ons begrip van de eierstok vergroten, met een specifieke nadruk op de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het opmerkelijke regeneratieve vermogen ervan. Naarmate 3D-menselijke eierstokmodellen zich blijven ontwikkelen, zal de afhankelijkheid van diermodellen in eierstokonderzoek afnemen, wat leidt tot innovatieve therapieën op het gebied van regeneratieve geneeskunde18.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>12-well Culture Plate</td><td>Corning</td><td>3336</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>28cm Cell Scraper</td><td>Greiner Bio-One</td><td>541070</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72024</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bead bath</td><td></td><td>M714</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-container "Mr. Frosty"</td><td>BD Falcom</td><td>479-3200</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-21448</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4736401</td><td></td></tr><tr><td>Follicle Stimulating Hormone (FSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>6652995</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-1502</td><td>Mesenchymale Cellen; Wong et al 1999 (mens)25</td></tr><tr><td>Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135)</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>AF1658</td><td>Apicale Polariteit; Bryant et al 2014 (hond)21</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>263-EG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4736401</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II&nbsp; celteller</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&rsquo;s 5A Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26600-023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-ITGB1 (integrine beta 1)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-53711</td><td>Basolaterale Polariteit; Bryant et al 2014 (hond)21</td></tr><tr><td>Mouse anti-KRT8 (cytokeratine 8)</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-101459</td><td>OSE-cellen; Kopper et al 2019 (mens)12</td></tr><tr><td>Mouse anti-VIM (vimentine)</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB0809</td><td>Mesenchymale Cellen; Abedini et al 2020 (muis)19</td></tr><tr><td>Mycozap Plus-CL</td><td>Lonza</td><td>V2A-2011</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG)</td><td>Merk</td><td>G03GA08</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron&nbsp;(P4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-ACTA2 (alpha gladde spieractine)</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB5694</td><td>Mesenchymale Cellen; Abedini et al 2020 (muis)19</td></tr><tr><td>Rabbit anti-CDH1 (E-cadherine)</td><td>Cell Signaling&nbsp;</td><td>CST 3195S</td><td>Epitheelcellen; Wong et al 1999 (mens)25</td></tr><tr><td>Rabbit anti-LGR5</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB75850</td><td>OSE-progenitorcellen; Flesken-Nikitin et al 2013 (muis)22</td></tr><tr><td>Rabbit anti-YAP</td><td>Cell Signaling&nbsp;</td><td>14074S</td><td>Prolifererende OSE; Wang et al 2022 (muis)24</td></tr><tr><td>Rat anti-CD44 PE-geconjugeerd</td><td>eBioscience</td><td>12-0441-81</td><td>OSE-progenitorcellen; Bowen et al 2009 (mens)20</td></tr><tr><td>Recombinant Human Heregulin&beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Wnt3a</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rspondin-1&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Red blood cells lysis buffer</td><td>eBiosciences</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Revitacell Supplement (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A26445-01</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1624/10</td><td></td></tr><tr><td>Sheep anti-COL1A1 (pro-collageen 1 alpha 1)</td><td>R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>AF6

menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

Human Ovarian Surface Epithelium Organoids as a Platform to Study Tissue Regeneration

Het ovariumoppervlakepitheel (OSE), de buitenste laag van de eierstok, scheurt tijdens elke ovulatie en speelt een cruciale rol bij de wondgenezing van de eierstokken terwijl de integriteit van de eierstokken wordt hersteld. Bovendien kan de OSE dienen als de bron van epitheliale eierstokkanker. Hoewel de regeneratieve eigenschappen van OSE goed zijn bestudeerd bij muizen, blijft het begrijpen van het precieze mechanisme van weefselherstel in de menselijke eierstok belemmerd door beperkte toegang tot menselijke eierstokken en geschikte in-vitrokweekprotocollen . Weefselspecifieke organoïden, geminiaturiseerde in vitro modellen die zowel structurele als functionele aspecten van het oorspronkelijke orgaan repliceren, bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van orgaanfysiologie, ziektemodellering en het testen van geneesmiddelen. 
Hier beschrijven we een methode om primaire menselijke OSE (hOSE) te isoleren uit hele eierstokken en hOSE-organoïden vast te stellen. We nemen een morfologische en cellulaire karakterisering op die heterogeniteit tussen donoren aantoont. Daarnaast tonen we het vermogen van deze kweekmethode aan om hormonale effecten op de groei van OSE-organoïden gedurende een periode van 2 weken te evalueren. Deze methode kan de ontdekking van factoren die bijdragen aan OSE-regeneratie mogelijk maken en patiëntspecifieke geneesmiddelscreenings voor kwaadaardige OSE vergemakkelijken.

2D hOSE-cultuur Vers geïsoleerde hOSE-cellen werden op een plaat met 12 putjes geplaatst en gedurende 3 weken gekweekt. Gedurende deze periode werden cellen drie keer gepasseerd (Figuur 2A). Primaire hOSE-cellen in cultuur vertoonden een geplaveide morfologie tot passage 3 (P3), maar begonnen daarna tekenen van veroudering te vertonen, in overeenstemming met eerdere resultaten die de beperkte periode rapporteerden dat hOSE kan worden gepasseerd27. Bovendien is aangetoond dat OSE van muizen in vitro een epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT) ondergaat, met fibroblastachtige kenmerken zoals herschikking van het actine-cytoskelet en afzetting van collageen I19. In overeenstemming vertoonde ACTA2+CD44+ hOSE een uitgesproken opregulatie van COL1A1 tussen P2 en P3 (Figuur 2B), wat suggereert dat hOSE-cellen EMT ondergaan tijdens de kweek.
TGF-β-signalering is een belangrijke regulator van EMT28 die in staat is EMT te induceren in verschillende epitheelceltypen29. Hoewel TGF-β niet aan de OSE_2D media werd toegevoegd, kon het toegevoegde FBS detecteerbare niveaus van dit cytokine bevatten30,31. Om deze reden hebben we getest of de toevoeging van de TGF-β remmer type I-receptor SB-431542 EMT zou kunnen voorkomen, waardoor langdurige 2D-cultuur mogelijk is. Verrassend genoeg belemmerde suppletie van de OSE_2D media met 10 μM SB-43154232de celproliferatie (Figuur 2C). We concludeerden dat TGF-β-signalering essentieel is voor OSE-proliferatie, en verdere 2D-kweekexperimenten werden uitgevoerd zonder de remmer.
3D hOSE organoïde cultuur Op basis van gepubliceerde kweekomstandigheden om menselijke OSE-organoïden12 te laten groeien, hebben we hOSE-organoïden afgeleid die zijn ingebed in druppeltjes BME en gedurende maximaal 28 dagen in OSE_3D medium zijn gekweekt (met een standaardconcentratie van 100 nM oestradiol). Binnen 7 dagen waren veel hOSE-organoïden afkomstig van vers geïsoleerde OSE-cellen cystisch met een gemiddelde diameter van 130 mm (Figuur 3A,B). Deze resultaten waren vergelijkbaar met die gerapporteerd door Kopper en collega's over de afleiding van hOSE-organoïden uit gehakt en enzymatisch verteerd menselijk eierstokweefsel12. Interessant is dat hOSE-organoïden afgeleid van vers geïsoleerde OSE-cellen na 14 dagen in cultuur groter werden (gemiddelde diameter van 160 mm) dan hOSE-organoïden van 2D-geëxpandeerde OSE-cellen (gemiddelde diameter van 100 mm) (Figuur 3B), waarschijnlijk als gevolg van de neiging van de 2D-geëxpandeerde OSE-cellen om proliferatie te verminderen. Bovendien, terwijl veel 3D hOSE-organoïden bestonden uit een monolaag van platte epitheelcellen (Figuur 3C linksboven paneel), vertoonden sommige een kubusvormige monolaag van cellen (Figuur 3C rechtsboven paneel), andere waren meerlagig (Figuur 3C rechtsonder paneel) of vormden een niet-lumenized celcluster (Figuur 3C linksonder paneel).
Om te testen of hOSE-organoïden ook met behulp van OSE_2D medium konden worden afgeleid, werden vers geïsoleerde hOSE-cellen ingebed in druppeltjes BME en gedurende 12 dagen in OSE_2D media gekweekt. Na 6 dagen waren spoelvormige cellen zichtbaar, wat suggereert dat hOSE-cellen EMT ondergingen in de druppels. Belangrijk is dat er geen hOSE-organoïden werden gevormd met behulp van OSE_2D medium (Figuur 3D).
Cellulaire kenmerken van de hOSE-organoïden In de menselijke volwassen eierstok markeert keratine 8 (KRT8) specifiek de OSE-populatie (Figuur 4A), en dienovereenkomstig behielden hOSE-organoïden de KRT8-expressie, waardoor hun celidentiteit werd gevalideerd (Figuur 4B). In OSE-cellen van muizen was de nucleaire lokalisatie van Yes1-geassocieerd eiwit (YAP1) specifiek geassocieerd met OSE-stam-/voorlopercellen die in staat waren om het gewonde gebied na de eisprong uit te breiden en te genezen24,33. YAP vertoonde nucleaire lokalisatie in de meerderheid van de cellen in hOSE-organoïden, onafhankelijk van hun grootte (Figuur 4B). Andere markers waarvan werd gemeld dat ze tot expressie kwamen in OSE-cellen van muizen, zoals CD4420 en LGR522, werden ook onderzocht. Interessant is dat zowel CD44 als LGR5 tot expressie werden gebracht in kleine hOSE-organoïden (<100 μm diameter), terwijl CD44 en LGR5 in grotere organoïden gedownreguleerd leken (Figuur 4B).
Vervolgens onderzochten we of hOSE-organoïden de apicaal-basale polariteit vertoonden die doorgaans wordt waargenomen in BME-ingebedde organoïden (apical-in)34. Basolateraal eiwit integrine bèta 1 (ITGB1) en apicaal eiwit podocalyxine (PODXL) werden gebruikt om de celpolariteit in de hOSE-organoïden aan te tonen, wat een duidelijke apicale polariteit bevestigt, onafhankelijk van de grootte van de hOSE-organoïde (Figuur 4B).
Van humane OSE is bekend dat het de mesenchymale marker N-cadherine (CDH2) tot expressie brengt, terwijl de expressie van epitheliale marker E-cadherine (CDH1) beperkt is tot zuilvormige OSE-cellen (Figuur 4A)2. Interessant is dat hOSE-organoïden die in dit werk zijn afgeleid, mesenchymale markers CDH2 en vimentin (VIM) tot expressie brachten, en grote cystische hOSE-organoïden met kubusvormige/zuilvormige epitheel zowel CDH1+ als CDH2+VIM+ waren (Figuur 4C). Het blijft onduidelijk of CDH1+ hOSE-organoïden zijn afgeleid van primaire CDH1+ OSE-cellen of van CDH1-OSE-cellen die in vitro epitheliale differentiatie of (neoplastische) transformatie ondergingen 25,35.
Presentatie van het gebruik van hOSE-organoïden: effect van ovulatoire signalen op hOSE-organoïden De hormonen follikelstimulerend hormoon en humaan choriongonadotrofine kunnen worden gebruikt om follikelgroei en ovulatie te induceren, terwijl er na de eisprong een duidelijke toename is van de concentratie van door eierstokken geproduceerde hormonen, zoals progesteron en estradiol36. Om de bruikbaarheid van hOSE-organoïden als screeningsplatform aan te tonen, hebben we het effect van deze hormonen op hOSE-organoïden onderzocht, waarbij we het aantal en de grootte van organoïden gebruikten als kwantificeringsoutput (met behulp van Fiji). Hiervoor hebben we hOSE-organoïden afgeleid in OSE_3D media zonder oestradiol (geen hormoon) en in OSE_3D media die FSH, hCG, oestradiol of progesteron bevatten in verschillende concentraties (Figuur 5A).
Het aantal hOSE-organoïden afgeleid van gecryopreserveerde-ontdooide (niet-geëxpandeerde) hOSE-cellen van 3 verschillende donoren (n=3) werd gekwantificeerd per druppel na 7 dagen kweek (Figuur 5A,B). De cultuurmedia werden elke 3 dagen veranderd. Er werden geen significante verschillen waargenomen in het totale aantal hOSE-organoïden per druppel dat werd gevormd in medium-bevattende hormonen in vergelijking met medium zonder hormonen (Figuur 5A,B). Om het effect van de hormonen op de grootte van de organoïden te kwantificeren, werd na 14 dagen in cultuur elke druppel (van elke aandoening) in beeld gebracht en werd het gebied van de 4 grootste hOSE-organoïden gemeten met behulp van Fiji. Interessant is dat het genereren van hOSE-organoïden van twee verschillende donoren (n = 2) in aanwezigheid van progesteron (1000 nM) of estradiol (200 nM) resulteerde in ten minste één zeer grote organoïde (ongeveer 700 μm diameter) per druppel (Figuur 5C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de isolatie van hOSE-cellen uit hele eierstokken. Eierstokken werden gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een digestieoplossing. hOSE-cellen werden losgemaakt van het eierstokoppervlak door voorzichtig te schrapen en vervolgens te cryopreserveeren, direct geplateerd op 2D OSE-cultuur in monolaag, of ingebed in basaalmembraanextract (BME) voor 3D hOSE-organoïdecultuur. Gecryopreserveerde ontdooide hOSE-cellen kunnen worden gebruikt voor 2D-cultuur of 3D-organoïdevorming, en 2D-geëxpandeerde hOSE-cellen kunnen worden gebruikt om 3D hOSE-organoïden te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig02.jpg"> Figuur 2: 2D primaire kweek van hOSE-cellen. (A) Helderveldbeelden van hOSE-cellen bij passages 0 (P0), 2 (P2) en 3 (P3) die de typische epitheliale geplaveide morfologie weergeven. Schaalbalken zijn 750 μm op de bovenste panelen en 125 μm op de onderste panelen. (B) Immunofluorescentie voor ACTA2, CD44, COL1A1 op 2D hOSE-cellen op P2 en P3. Schaalbalken zijn 50 μm. (C) Helderveldbeelden van hOSE-cellen gekweekt met 10 μM SB-431542 op P0, P2 en P3. Cellen vertoonden tekenen van veroudering van P2 en bereikten geen hoge confluentie tijdens de kweek. Schaalbalken zijn 750 μm op de bovenste panelen en 125 μm op de onderste panelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig03.jpg"> Figuur 3: Morfologische karakterisering van hOSE-organoïden. (A) Helderveldbeelden van drie onafhankelijke hOSE-organoïde-derivaten van drie verschillende donoren (tOVA86, tOVA87, tOVA88). De foto's werden gemaakt na het inbedden van cellen (D0), dag 7 (D7), dag 14 (D14) en dag 28 (D28) van de kweek. Schaalbalken zijn 750 μm bij D0 en 50 μm voor de rest. (B) Diameter van hOSE-organoïden afgeleid van vers geïsoleerde hOSE-cellen (stippellijn) en 2D-geëxpandeerde hOSE-cellen (ononderbroken lijn). Afgebeeld is de gemiddelde grootte ± standaarddeviatie gemeten op D0, D7 en D14. Resultaten van twee verschillende donoren (tOVA88 en tOVA89) worden getoond. (C) Helderveldafbeeldingen van hOSE-organoïden met verschillende morfologieën: enkele platte laag (linksboven), enkele kolomvormige laag (rechtsboven), meerlagig (rechtsonder) en niet-lumenized celaggregaat (linksonder). Schaalbalken zijn 100 μm. (D) Helderveldbeelden van hOSE-cellen ingebed in BME en gedurende 12 dagen gekweekt met OSE_2D media. De foto's zijn gemaakt na het insluiten van cellen (D0), dag 6 (D6), dag 9 (D9) en dag 12 (D12). Fibroblastachtige cellen haalden de cultuur in en er werden geen organoïde-achtige structuren gevormd. Schaalbalken zijn 750 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig04.jpg"> Figuur 4: Cellulaire karakterisering van hOSE-organoïden. (A) Immunofluorescentie voor KRT8 en CDH1 in de menselijke eierstoksectie. De schaalbalk op het linkerpaneel is 500 μm en het middelste en rechterpaneel zijn 50 μm. (B) Immunofluorescentie voor KRT8 en YAP, LGR5 en CD44, en ITGB1 en PODXL in hOSE-organoïden van verschillende grootte (<50 μm, 50-75 μm, 75-100 μm, >100 μm). Schaalbalken zijn 50 μm. (C) Immunofluorescentie voor VIM, CDH1, CDH2 in hOSE-organoïden. Schaalbalken zijn 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66797/66797fig05.jpg"> Figuur 5: Effect van ovulatoire signalen op de vorming van hOSE-organoïden. (A) Totaal aantal hOSE-organoïden per druppel gevormd op dag 7 in verschillende kweekmedia. De hOSE-organoïden zijn afkomstig van drie verschillende donoren (tOVA77, tOVA79, tOVA83). Vetgedrukt is het OSE_3D medium dat wordt gebruikt voor het afleiden van organoïden. (B) Relatieve organoïdevorming in vergelijking met medium zonder hormonen. Gepoolde waarden van hOSE-organoïden werden afgeleid van drie verschillende donoren (tOVA77, tOVA79, tOVA83). (C) Grafiek van het beeldgebied van de 4 grootste hOSE-organoïden op dag 14 in elk van de geteste experimentele omstandigheden van twee verschillende donoren (tOVA77, tOVA83). (D) Brightfield-afbeeldingen van hOSE-organoïden op dag 14 met medium zonder hormonen, 200 nM E2 en 1000 nM P4 van twee verschillende donoren (tOVA77, tOVA83). Schaalbalken zijn 750 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/66797fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Samenstelling van de in het onderzoek gebruikte werkoplossingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66797/Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft het maken van driedimensionale (3D) weefselorganoïden uit primaire menselijke ovariumoppervlakte-epitheel (hOSE) cellen. Het protocol omvat isolatie van hOSE uit vers verzamelde eierstokken, cellulaire expansie van de hOSE, cryopreservatie-ontdooiprocedures en organoïde-afleiding. Immunofluorescentie, kwantitatieve analyse en het demonstreren van het nut als screeningplatform zijn inbegrepen.

Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

The ovarian surface epithelium (OSE), the outermost layer of the ovary, undergoes rupture during each ovulation and plays a crucial role in ovarian wound ...

human-ovarian-surface-epithelium-organoids-as-platform-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.

Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

We beschrijven methoden om somatische cellen van muis-ovariumcellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van de eierstok en om somatische organoïden van muis-ovarium te genereren met een steigervrije benadering.

Onderzoek naar de ovariummicroomgeving: Methoden voor isolatie, 2D-kweek en organoïde kweek van somatische cellen van muis eierstokcellen

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Ontdek hoe je 3D organoïden kweekt uit menselijk ovarieel oppervlakte-epitheel voor onderzoek naar weefselregeneratie. Deze methode biedt een waardevol platform voor reproductieve gezondheidsstudies.

Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

Meer video's verkennen