Een webgebaseerde workflow voor het selecteren van gen- en weefselspecifieke versterkers

We zijn geïnteresseerd in het decoderen van het niet-coderende genoom om te begrijpen hoe genen worden gereguleerd, om op het juiste moment en op de juiste plaats tot expressie te komen. We ontwikkelen gebruiksvriendelijke protocollen met behulp van webgebaseerde genomics-tools om verbeterde ontdekkingen toegankelijk te maken voor alle biologen. Brede beschikbaarheid van multimodale gegevens die kunnen helpen de locatie van enhancers te beperken en de gemakkelijke toegang tot deze gegevens via open source webinterfaces.

Dit maakt uitgebreide identificatie van verbeteraars mogelijk zonder dat er programmeerexpertise van onderzoekers nodig is. Dit protocol biedt een basis voor iedereen zonder een achtergrond in enhancer-biologie om te beginnen met het navigeren door openbaar beschikbare datasets om enhancers op te halen voor de genen die van belang zijn. We gebruiken TBX5, een bekende speler in de hartbiologie, als casestudy.

Onze workflow identificeerde 21 enhancers, die licht kunnen werpen op hartontwikkelingsmechanismen en aangeboren hartafwijkingen. We breiden ons protocol uit met nieuwe databronnen, waaronder ruimtelijke genomica, en ontwikkelen aanvullende gebruiksvriendelijke tools voor biologen. Open om te beginnen de Ensembl Genome Browser.

Selecteer de genoomassemblage die overeenkomt met de soort en versie van interesse. Voer het gen van interesse in het zoekveld in en klik op Go.Klik in de resultaten op de juiste Ensembl-gen-ID.Scrol vervolgens naar de sectie Samenvatting en klik op de link Regio in detail" om de omliggende regio van het gen van interesse te visualiseren. Zoek nu naar de twee genen die het gen van interesse flankeren met behulp van de Gene Legend-track.

Deze genen verschijnen als visuele elementen die samengevoegde Ensembl- en Havana-annotaties vertegenwoordigen binnen de basisgenannotaties van het GENCODE-spoor. Bepaal de richting van het gen van belang door de grotere of kleinere dan tekens naast de gennamen te observeren. Klik en sleep de cursor over het intergene gebied tussen deze genen en klik vervolgens op Ga naar regio" in het pop-upvenster om het geselecteerde gebied weer te geven.

Pas de weergave aan door te klikken op Toevoegen "of Tracks verwijderen" bovenaan de trackviewer. Gebruik de zoom- en navigatieknoppen om de weergave aan te passen voor een betere visualisatie van de regio. Klik in de tabbladviewer Regio in detail" op Deze pagina configureren" in de zijbalk.

Selecteer in de zijbalk Regio-afbeelding configureren onder Regulering de optie Activiteit per cel of weefsel. Gebruik de zoekbalk voor cellen of weefsels om de gewenste weefsels te zoeken en te selecteren, of gebruik de alfabetische index onder de balk. Klik op het tabblad Experimenten naast de optie Cel of Weefsel.

Kies H3K4me1 en H3K27ac als markering voor verbeteraars en H3K4me3 als markering voor promotors en klik op Trackweergave configureren. Selecteer vervolgens View Tracks" om regio's te visualiseren die zijn gemarkeerd met H3K4me1 binnen het detectiegebied van de enhancer en regio's gemarkeerd door H3K4me3 stroomopwaarts van het gen van interesse. Klik op de gekleurde visuele of kaderelementen in de H3K4me1-track om de genomische coördinaten op te halen van regio's die zijn gemarkeerd binnen het gedefinieerde detectiegebied.

Dit opent de pop-up Hists en Pols, die de genomische locatie van het element in basenparen weergeeft. U kunt ook handmatig de interessegebieden voor elk genomisch kenmerk definiëren door op de track te klikken en te slepen om grafiekpieken onder de H3K4me1- of H3K27ac-tracks te omsluiten. Kopieer vervolgens de genomische locatiecoördinaten in een tekstbestand en sla het bestand op in BED-formaat.

Ga naar het 4DN Data Portal. Zorg er op de startpagina voor dat Experimentsets" is geselecteerd als de Y-as van de gestapelde hoofdbalk, Experimenttype" is geselecteerd als de X-as en de plot is gegroepeerd per organisme. Zoek de In Situ Hi-C-balk langs de X-as en klik op het gedeelte dat menselijke experimentsets vertegenwoordigt.

Klik in de pop-up op de knop Bladeren" en selecteer hartspiermyoblasten" en ons interessegen, TBX5, geassocieerd met hartorganogenese. Klik op de link in de kolom Titel van het relevante biomonster dat overeenkomt met het weefsel van belang. Klik vervolgens op het tabblad Verwerkte bestanden op Gegevens verkennen" om de Hi-C-gegevensset in meer detail te bekijken.

Voer de coördinaten van de geïdentificeerde promotor in het weefsel van interesse in en klik met de rechtermuisknop op de heatmap om de regio horizontaal te markeren. Met deze lijnen kan de promotorregio visueel worden gevolgd op de heatmap. Pas indien nodig de weergave aan door deze verticaal te slepen totdat de boven- en ondergrenzen in de Y-coördinaten van de zoekbalk zijn uitgelijnd met de grenzen van het interessegebied.

Als u ongewenste lijnen wilt verwijderen, klikt u met de rechtermuisknop op de lijn en selecteert u Horizontaal of Verticale lijn en klikt u vervolgens op Serie sluiten. Voer de coördinaten van alle experimenteel gevalideerde controleversterkers in om de interactiedrempel te berekenen op basis van hun minimale interactiewaarden. Toon de drie controleverbeteraars uit de literatuur naast het promotorgebied van Ensembl met behulp van de vooraf voorbereide weergave.

Definieer vervolgens de drempel voor de promotorverbetering met behulp van deze controleverbeteraars door de laagste interactiescore zonder nul te selecteren, zoals aangegeven door de kleursleutel aan de rechterkant van de heatmap-matrix. Voer de genomische coördinaten van alle H3K4me1-geassocieerde enhancer-regio's in en markeer deze verticaal op de Hi-C-heatmap. Filter zwak interagerende regio's uit door de interactiescores van H3K4me3-gemarkeerde regio's te vergelijken met de interactiedrempel.

Selecteer de genomische coördinaten die interactiefrequenties boven deze drempel weergeven, die verschijnen als meer geconcentreerde of donkerdere signalen op de heatmap, en sla ze op in BED-indeling. Drie van de vier cardiale versterkers die in de VISTA Cardiac Enhancer Browser werden geïdentificeerd, HS2329, mm1282 en mm370, overlapten met regio's die werden voorspeld door het webgebaseerde detectieprotocol voor enhancer. Enhancer Two overlapte zowel een gebied dat werd voorspeld door het detectieprotocol van de enhancer als een experimenteel gevalideerde enhancer.

Enhancer 16 vertoonde overlap met zowel voorspelde enhancer-regio's als eerdere experimentele gegevens. Enhancer Nine overlapte niet met voorspelde enhancers uit de pijplijn, maar vertoonde gedeeltelijke H3K4me1-signaalverrijking.