Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden
August 9th, 2024
Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.
In dit werk presenteren en vergelijken we sferoïde vormingsmethoden die kunnen worden gebruikt voor analyse van celmetabolisme en zuurstofverdeling met behulp van levende celmicroscopie. In de afgelopen jaren is fluorescentiebeeldvormingsmicroscopie op grote schaal gebruikt om metabole biomarkers zoals NADPH en FAD in levende cellen te onderzoeken, en er zijn verschillende fluorescerende nanodeeltjes ontwikkeld om dergelijke metingen te multiplexen met beeldvorming van cel- en weefseloxygenatie. Meercellige sferoïden, organoïden en organ-op-een-chip kunnen een complexe, in-vivo-achtige micro-omgeving nabootsen, waardoor de noodzaak in dieronderzoek wordt geminimaliseerd.
Voor de productie van sferoïde tonen we verschillende vormingsmethoden, die kunnen variëren van lage tot hoge doorvoer. Ze benadrukken ook hun optische toegankelijkheid, compatibiliteit met een fluorescentie-levenslange beeldvormingsmicroscoop en de mogelijkheid om extracellulaire matrixcomponenten op te nemen. Dus hoewel 3D in vitro modellen een betere context bieden in vergelijking met 2D-culturen, blijven hun hoge variabiliteit, lage reproduceerbaarheid en onvolledige experimentele rapportage een probleem.
Parameters zoals de sferoïde grootte, de samenstelling van de voedingsstoffen, de extracellulaire viscositeit en zelfs sferoïde vormingsmethoden kunnen allemaal leiden tot verhoogde cellulaire heterogeniteit. Met dit protocol willen we de productiemethoden van sferoïde harmoniseren en standaardiseren, waarbij we de belangrijkste aspecten benadrukken die belangrijk zijn voor levenscontinue en multiparametrische analyse van sferoïden met behulp van FLIM-microscopie.
Overzicht
Dit artikel presenteert verschillende methoden voor het vormen van multicellulaire sferoïden om celmetabolisme en zuurstofverdeling te analyseren met behulp van levende celmicroscopie. De studie benadrukt het gebruik van fluorescentie-levensduur beeldvorming microscopie (FLIM) om metabolische biomarkers in levende cellen te onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Levende celbeeldvorming
Achtergrond
- Multicellulaire sferoïden en organoïden repliceren micro-omgevingen die lijken op in-vivo-omgevingen.
- Fluorescentie-levensduur beeldvorming microscopie wordt gebruikt om metabolische biomarkers te bestuderen.
- Hoge variabiliteit en lage reproduceerbaarheid zijn uitdagingen in 3D in-vitro-modellen.
- Verschillende methoden voor sferoïdvorming kunnen worden toegepast voor verschillende toepassingen.
Doel van het onderzoek
- Om methoden voor sferoïdvorming voor levende celmicroscopie te vergelijken.
- Om celmetabolisme, hypoxie en celdood in 3D-modellen te analyseren.
- Om het begrip van zuurstofverdeling in multicellulaire systemen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fluorescentie-levensduur beeldvorming microscopie (FLIM)
- Analyse van cellulaire autofluorescentie
- Gebruik van kleurstoffen en fluorescente nanodeeltjes
- Verschillende technieken voor sferoïdvorming
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde methoden voor het analyseren van celmetabolisme in 3D-sferoïden.
- Toonde de compatibiliteit van sferoïds met FLIM voor metabolische studies.
- Benadrukte de belangrijkheid van extracellulaire matrix componenten in sferoïdvorming.
- Behandelde uitdagingen in reproduceerbaarheid en variabiliteit van 3D-culturen.
Conclusies
- Verschillende methoden voor sferoïdvorming kunnen de analyse van levende cellen verbeteren.
- FLIM biedt waardevolle inzichten in metabolische processen in 3D-modellen.
- Continue ontwikkeling van deze methoden kan de afhankelijkheid van diermodellen verminderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
