Name: Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer de productie van meercellige sferoïden voor live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM). Deze methode analyseert celmetabolisme en zuurstofverdeling in 3D-modellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het Speciaal Onderzoeksfonds (BOF) van de Universiteit Gent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO, I001922N) en de Europese Unie, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN nr. 101073507.

Meercellige sferoïde vorming voor FLIM-gebaseerde metabole en hypoxie-analyse

Niets te onthullen.

Meercellige sferoïden worden een voorkeursmethode bij de studies van tumor- en stamcelniche-micro-omgevingen, de ontdekking van geneesmiddelen en de ontwikkeling van de 'weefselbouwstenen' voor biofabricage. De heterogene interne architectuur, gradiënten van voedingsstoffen en oxygenatie van sferoïden kunnen die van in vivo weefsels en tumoren nabootsen in een relatief vereenvoudigde en toegankelijke omgeving. Met de behoefte aan meer methodologische transparantie 26,28 en standaardisatie71, wordt verwacht dat deze protocollen onderzoekers zullen helpen bij het kiezen van de beste sferoïde vormingsmethode voor de live kwantitatieve fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie-experimenten. De gepresenteerde methoden maken gebruik van nanodeeltjessensoren voor celkleuring en intrinsieke cellulaire autofluorescentie, die gemakkelijk kunnen worden gecombineerd met celdood kleuren.
De meest kritieke stappen bevinden zich in het protocol voor de vorming van sferoïden; Voor de op agarose gebaseerde methode met hoge doorvoer is het dus essentieel om de agarosemallen voor de kweekmedia voldoende in evenwicht te brengen. Onvoldoende evenwichtstijd zal leiden tot de verdunning van voedingsstoffen in de resterende PBS en extra factoren met zich meebrengen voor sferoïde heterogeniteit 21,26,72,73. De vers gemaakte agarosevorm moet ook visueel worden gecontroleerd op de aanwezigheid van luchtbellen, microscheurtjes en andere defecten.
Hoewel efficiënt voor beeldvorming, kan de suspensie van nanodeeltjes zelfaggregatie vertonen en de vorming van onregelmatig gevormde sferoïden veroorzaken bij methoden voor de vorming van lage gehechtheid. Dit kan vaak worden verzacht door serum toe te voegen aan de kweekmedia of door de monolaagse celcultuur vooraf te kleuren voordat sferoïde wordt gevormd. Vaak kan tijdens sferoïde verdichting een toevoeging van een kleine hoeveelheid nanodeeltjes (bijv. 10% van de initiële kleuringsconcentratie) ook helpen bij het kleuren van de prolifererende zone van de sferoïden. Ten slotte is het belangrijk om bij alle vormingsmethoden "stofvrije" steriele pipetpunten te gebruiken.
Tijdens beeldvormingsexperimenten moet altijd rekening worden gehouden met de mogelijke impact van verlichting op de levensvatbaarheid van cellen. Het is dus belangrijk om de risicofactoren te kennen die een negatieve invloed hebben op elk live beeldvormingsexperiment. Over het algemeen omvat fotoschade verschillende mechanismen: (1) hoge lokale temperatuurstijging, (2) mechanische stress en (3) fotochemische stress (oxidatieve en vrije radicalenreactie)74. Afhankelijk van de beeldvormingsmodaliteit (bijv. confocale beeldvorming met één foton versus beeldvorming met meerdere fotonen, continue versus pulsverlichtingsmodi, de gevoeligheid van detectoren en het vermogen van de lichtbron op verschillende golflengten als de excitatieafstemming mogelijk is), cel- en weefseltype (bijv. weefseltype-afhankelijke accumulatie van efficiënt lichtabsorberende pigmenten of andere autofluorescentiemoleculen, 3D- versus 2D-organisatie, groei en samenstelling van beeldvormingsmedia), de oorsprong van de fluorescerende sonde (bijv. fotosensibiliserende eigenschappen) verschillende combinaties van risicofactoren kunnen fototoxiciteit veroorzaken tijdens beeldvorming. Bovendien, zelfs als er geen toename van celdood wordt waargenomen na verlichting, kunnen lichtkrachtafhankelijke eerdere pre-death effecten op mitochondriën en metabolisme mogelijk interfereren met experimentanalyse en -interpretatie55.
Om de fototoxische impact op experimentele resultaten uit te sluiten, moet de onderzoeker algemene monitoring uitvoeren van de levensvatbaarheid van cellen en veranderingen in de celmorfologie in vergelijking met intacte controle, of met behulp van celdoodsondes om de toename van het celsterftecijfer na verlichting te schatten. Als de metabole experimenten worden uitgevoerd, moet de optimalisatie van de beeldvormingsparameters dienovereenkomstig worden uitgevoerd in de pilootexperimenten om de beeldvormingsimpact op de gemeten metabole parameters te schatten en te minimaliseren. In het geval van zuurstofgevoelige sondes kan de overdosis licht gemakkelijk worden gevolgd door een plotselinge toename van de levensduur en intensiteit van de O2-gevoelige kleurstoffosforescentie (overeenkomstige veranderingen in de intensiteitsverhouding van de referentie ten opzichte van deO2-gevoelige kleurstof) als gevolg van het zogenaamde "foto-geïnduceerde O2-verbruik"53,75. Dit kan eenvoudig worden gedaan door kinetische curve-analyse van time-lapse-experimenten met verschillende lichtvermogensparameters, bijvoorbeeld met behulp van het volgende gepubliceerde protocol25. Ter 'verdediging' van de pulsverlichting (bijv. gebruikt in TCSPC-F(P)LIM-microscopie), toonden de recente studies de minimale impact ervan aan op de ROS-productie en het fotobleken van de sonde in vergelijking met steady-state verlichtingsmetingen76,77, wat wijst op een bijkomend voordeel van TCSPC-FLIM versus conventionele op intensiteit gebaseerde beeldvormingsbenadering.
De belangrijkste beperking van de gepresenteerde sferoïde vormingsmethoden ligt in directe en langdurige monitoringtoepassingen. De agarosemallen vereisen een objectief met een lange werkafstand (of een extra rechtopstaande microscoop of fluorescentie-stereomicroscoop) vanwege de dikke laag agarose en het materiaal van de 5D Spheriplate kan de metingen in rode fluorescerende kanalen (O 2-sonde) verstoren. De sferoïde grootte die wordt geproduceerd door methoden met een hoge doorvoer wordt beperkt door de diameter van de microwell en vereist frequente media-uitwisseling om uitputting en verzuring van media te voorkomen. Met al deze beperkingen raden we de 3D-petrischaaltjes (MicroTissue) aan voor experimenten die een hoge doorvoer vereisen (bijv. voor 3D-bioprinttoepassingen) en methoden met een lage hechting voor basisstudies met een "gemiddelde doorvoer", die ook een lager aantal cellen vereisen.
Ratiometrische oxygenatiemonitoring en conventionele experimenten met fluorescentiekleurstof op basis van levende cellen zijn betaalbaar op algemeen verkrijgbare omgekeerde microscopen als ze zijn uitgerust met een nabij-infrarood (NIR)-gevoelige camera, op lichtgevende diode (LED) gebaseerde excitatie en geschikt objectief25. Voor meer geschikte optische doorsnede en FLIM worden kant-en-klare commerciële confocale microscoopsystemen (zoals hier beschreven) aanbevolen. Hoewel we ook een methode beschrijven voor het detecteren van NAD(P)H-autofluorescentie, waarvoor een duurdere twee-foton FLIM-microscoop nodig is, zijn er veel verschillende benaderingen, compatibel en nuttig voor confocale FLIM-systemen, idealiter uitgerust met witlichtlaser en hybride of SPAD-detectoren. Deze omvatten beoordeling van het celmetabolisme, FRET-FLIM biosensoreiwitten, beeldvorming van cel- en weefselmechanica, autofluorescentie van specifieke cel- en weefseltypes, en receptor-geneesmiddelinteracties gevisualiseerd via FLIM-FRET31.
De door de leverancier geleverde FLIM-acquisitie- en analysesoftware kan het succes van het experiment beïnvloeden, aangezien het niet altijd mogelijk is om de IRF of de afbeeldingen te exporteren in een formaat dat compatibel is met de downstream open-sourceanalyse. Nabewerking is een belangrijk onderdeel van de FLIM-analyseworkflow en is nog steeds niet universeel gestandaardiseerd of geaccepteerd. Curve-aanpassing vereist een hoger aantal fotonen en meer rekenkracht in vergelijking met de fasorbenadering. FLIMfit45 (globaal en pixel-voor-pixel passen) en Flimview78 behoren tot de open software die wordt gebruikt voor curve-fittinganalyse, terwijl PAM79, FLUTE64 en AlliGator80 worden gebruikt voor fasoranalyse. FLIMJ46 is een handige ImageJ-plug-in die met beide benaderingen werkt. Al met al helpen deze opties de nabewerkingsroutine te verbeteren en sneller, veelzijdiger en gebruiksvriendelijker te maken.

Meercellige sferoïden vertegenwoordigen een groep 3D-weefselmodellen die zijn verkregen door de zelfaggregatie van cellen en die een bolvorm vertonen. Ze worden veel gebruikt om de interactie tussen cellen en cellen en cellen in vitro na te bootsen en om een 3D-context te reproduceren binnen een groot aantal van kanker en stamcellen afgeleide constructies. Er worden verschillende technieken gebruikt om de celhechting te verminderen en de aggregatie te bevorderen. Deze omvatten de ophang-druppelmethode die afhankelijk is van de oppervlaktespanning1; methoden voor het afstoten van celhechting, zoals ultralage bevestigingsplaten, micromallen en microwells 2,3; benadering op basis van akoestische golven4; stroomgeïnduceerde aggregatiemethoden (spinnerkolven, bioreactor en microfluïdische apparaten)5; magnetische deeltjes-geassisteerde vorming6 en gebruik van de aggregatiebevorderende synthetische en ECM-gebaseerde matrices en steigers 7,8,9.
In kankeronderzoek, ontwikkeling en validatie van nieuwe medicamenteuze therapieën zijn sferoïden een aantrekkelijk model vanwege hun vermogen om de ruimtelijke diffusie-beperkte gradiënten van voedingsstoffen, afvalproducten en O2 te recapituleren, wat vaak leidt tot de vorming van een necrotische kern, typisch voor de solide tumoren10,11. Deze betrouwbaardere en geavanceerdere in-vitromodellen dagen de noodzaak uit van uitgebreid gebruik van diermodellen (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), volgens het 3V-principe van dieronderzoek (vervanging, vermindering en verfijning). Naast kanker vinden sferoïden hun toepassing in stamcelonderzoek. Pluripotente stamcellen hebben bijvoorbeeld het vermogen om embryoïde lichamen (EB) te vormen, die kunnen worden gebruikt voor de differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) naar gespecialiseerde celtypen die moeilijk rechtstreeks van patiënten te verkrijgen zijn, zoals neurale voorlopercellen13 of ovariumgranulosacellen13,14. Bovendien is de vorming van een EB vaak de eerste stap in de ontwikkeling van complexere organoïde modellen, bijvoorbeeld neuraal15, retinaal16, hart17, lever18, maag19 en darmorganoïden20. Factoren zoals grootte, reproduceerbaarheid, doorvoer en stroomafwaartse toepassingen moeten in overweging worden genomen bij het kiezen van een geschikte sferoïde vormingsmethode voor de experimenten.
De toegenomen complexiteit van 3D-cultuur kan leiden tot een hogere variabiliteit in vergelijking met 2D-cultuur. Factoren zoals de samenstelling van voedingsstoffen21, mediaverdamping22, viscositeit23, pH-regeling24, sferoïde vormingsmethode en zelfs de tijd in de cultuur25,26 kunnen resulteren in het verkrijgen van sferoïden met verschillende morfologie, groottes, levensvatbaarheid en verschillende chemoresistentie27,28. Recent onderzoek heeft aangetoond dat sferoïde zuurstofgradiënten niet altijd statisch zijn en worden beïnvloed door de vormingsmethode, de sferoïde grootte en extracellulaire viscositeit, wat de sferoïde heterogeniteit beïnvloedt29. Om de reproduceerbaarheid en toegankelijkheid van gegevens op sferoïden te verbeteren, is de MISpheroID-kennisbank ontwikkeld26, waarbij de cellijn, het kweekmedium, de vormingsmethode en de grootte van de sferoïden worden geïdentificeerd als de minimale informatie voor een reproduceerbaar resultaat. Daarom werd een gedetailleerde vergelijking gemaakt van meerdere high-throughput (SphericalPlate 5D, in het laboratorium gemaakte micromallen en Microtissue malls) en lage bevestigingsmethoden (d.w.z. Biofloat en met lipide gecoate 96-wells platen, zowel steigervrij als op steigers) (Figuur 1 en Tabel 1), inclusief de putgrootte (gegeven een schatting van de maximale sferoïde grootte), gebruikte verbruiksartikelen, bereidingstijd en de mogelijkheid om sferoïden te monitoren zonder ze naar microscopieschalen te transporteren. Dit laatste maakt langetermijnstudies mogelijk, terwijl sferoïden geproduceerd met high-throughput-methoden vaak resulteren in eindpuntexperimenten. Alle methoden, met uitzondering van de roosters van de 5DspheriPlate, brengen geen ongewenste autofluorescentie met zich mee, waardoor ze direct in microscopie kunnen worden gebruikt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figuur 1: Sferoïde vormingsmethoden uitgelegd. High-throughput methoden zoals de SphericalPlate 5D, die gepatenteerde microwells in de plaat heeft geïntegreerd, terwijl de in het laboratorium geproduceerde micromallen en de MicroTissue mallen stempels gebruiken om meerdere microwells in agarose (blauw) te maken. Platen met een lage hechting, zoals Lipidure (Amsbio) en Biofloat (Sarstedt), gebruiken een niet-hechtende coating die de hechting aan het celoppervlak remt en de zelfaggregatie van cellen bevordert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Zelf geproduceerde micromalls</td>
			<td>Microweefsel</td>
			<td>Lage bevestigingsmethoden</td>
		</tr><tr><td>Aantal sferoïden/putje</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Diameter goed</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr><tr><td>Volume van de cultuur</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Andere verbruiksartikelen</td>
			<td>/</td>
			<td>7 ml 3% agarose</td>
			<td>500 μL van 2% agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Bereidingstijd</td>
			<td>10 minuten</td>
			<td>2 uur + 3 dagen mediabewerking</td>
			<td>0,5 uur + 15 min media-aanpassing</td>
			<td>10–30 min + 1 uur drogen</td>
		</tr><tr><td>Monitoring</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nee**</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescerend</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nee</td>
			<td>Nee</td>
			<td>Nee</td>
		</tr><tr><td>Herbruikbaar</td>
			<td>Nee</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nee**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kosten</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Coating en Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Commerciële plaat met 96 putjes</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Sommige cellijnen hebben toevoeging van ECM nodig (d.w.z. 2%-5% Matrigel) om compacte sferoïden te vormen.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**De coating is herbruikbaar totdat deze leeg is. Elke plaat verbruikt echter een kleine hoeveelheid media en stof kan zich na verloop van tijd ophopen. Filtersterilisatie is regelmatig nodig.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Vergelijking van meerdere sferoïde vormingsmethoden29. "Monitoring": de mogelijkheid om sferoïde te bewaken zonder dat overdracht naar een microscopieschaal nodig is. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€: 150-500€ , €€€: >500€
Fluorescentiemicroscopie maakt directe monitoring mogelijk van de belangrijkste biologische aspecten in sferoïden, waaronder celdood, levensvatbaarheid, proliferatie, metabolisme, viscositeit en zelfs mechanische eigenschappen30. Fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) biedt een extra kwantitatieve dimensie voor het bestuderen van fluorescerende sonde-interacties binnen hun (micro)omgeving 31,32,33,34, waardoor de overlappende emissiespectra kunnen worden opgelost volgens verschillende emissielevensduurs 35,36 en het onderzoeken van het celmetabolisme op basis van intrinsieke cellulaire autofluorescentie. Zo kunnen wijdverspreide cellulaire autofluorescerende verbindingen zoals nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat (NAD(P)H), flavine-mononucleotide (FMN), flavine-adenine-dinucleotide (FAD), protoporfyrine IX en andere worden gemeten met één- en twee-foton FLIM en dienen als intrinsieke 'sensoren' van glucosekatabolisme, oxidatieve fosforylering (OxPhos) en geven een algemeen overzicht van de celredoxtoestand. NAD(P)H komt voor in vrije cytoplasmatische of in eiwitgebonden mitochondriale vormen37,38. Evenzo is de geoxideerde toestand van FAD fluorescerend met een langere levensduur van de vrije vorm. NAD(P)H- en FAD-microscopieën omvatten meestal twee-foton geëxciteerde FLIM, gericht op het voorkomen van fotoschade door monsters39. Vaak kan 'optische metabole beeldvorming' FLIM worden gecombineerd met het gebruik van op kleurstof gebaseerde sondes, genetisch gecodeerde biosensoren, fosforescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (PLIM) en op ratiometrische intensiteit gebaseerde metingen om een completer beeld te krijgen van het sferoïde of organoïde metabolisme, oxygenatie, proliferatie en levensvatbaarheid van cellen 29,30,31. Daarnaast kan FLIM ook worden gecombineerd met de Förster-resonantie-energieoverdrachtsmethode (FRET) om de levensduurvariatie van de donorfluorofoor te meten wanneer deze in nauw contact staat met de acceptor om de binding van een geneesmiddel met zijn doeldomein te onderzoeken 33,40,41.
De verkregen FLIM-beelden worden doorgaans geanalyseerd om de levensduur pixel voor pixel te berekenen. Momenteel zijn er ten minste 3 veelgebruikte strategieën die worden gebruikt om de fluorescentielevensduur te verkrijgen: semi-kwantitatieve 'snelle FLIM'42 (soms aangeduid als 'tau-sense'43,44), vervalcurve-aanpassing, met behulp van één-, twee- of drie-exponentiële aanpassing, en 'fittingvrije' benadering met fasetransformatie en fase-plotanalyse. Afhankelijk van de leverancier kan ofwel de meegeleverde (LAS X, Symphotime, SPCImage, enz.) ofwel open-source software (bijv. FLIMfit45, FLIMJ46 of andere47) worden gebruikt om gemeten FLIM-gegevens te verwerken. Doorgaans is door de leverancier geleverde software nuttig voor voorlopige gegevensanalyse, terwijl open-sourceoplossingen kunnen zorgen voor nauwkeurigere onderzoeken met behulp van bijvoorbeeld fasorplots en 3D-visualisatie.
Ondanks het nut en de aantrekkelijkheid van FLIM als methode voor het bestuderen van sferoïden, zijn er zeer weinig experimentele protocollen beschikbaar en is er een algemeen gebrek aan kennis bij het kiezen van de meest geschikte vormingsmethode voor succesvolle live multiparametrische microscopie-experimenten met FLIM. Hier wordt een gedetailleerde vergelijking gepresenteerd van veelgebruikte sferoïde vormingsprotocollen op basis van hun morfologie, levensvatbaarheid en oxygenatie met de onlangs gevalideerde en gekarakteriseerde verrode en nabij-infrarood (NIR) zuurstofgevoelige nanosensor (MMIR1). Het kationische nanodeeltje is geïmpregneerd met twee reporterkleurstoffen, de referentie O2-ongevoelige aza-BODIPY (excitatie 650 nm, emissie 675 nm) en de NIR O2-gevoelige metalloporfyrine, PtTPTBPF (excitatie 620 nm, emissie 760 nm). De MMIR1 maakt real-time analyse van zuurstofgradiënten mogelijk op een conventionele fluorescentiemicroscoop (met behulp van ratiometrische analyse) of fosforescentie-levensduurmicroscoop (PLIM) zonder cellulaire toxiciteit te introduceren en stabiele signalen, langdurige monitoring en multiplexing mogelijkte maken 25,29. Afhankelijk van de noodzaak om te kleuren met kleurstoffen of nanosensoren, sferoïde doorvoer of celtype, kan het meest geschikte vormingsprotocol worden gekozen. Aangezien de studies naar de levensvatbaarheid en oxygenatie van sferoïden relevant zijn voor studies van kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden, bevatten de gepresenteerde protocollen ook voorbeelden en verwachte typische resultaten van NAD(P)H-FLIM en FAD-FLIM met deze modellen. De gepresenteerde beeldvormings- en analysepijplijnen zijn gericht op de meest populaire op tijd gecorreleerde FLIM-microscopieplatforms op basis van enkelvoudige fotonentelling.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Ook verkrijgbaar bij Sigma</td></tr><tr><td>10 mL serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>12 well cell-cultuur platen, sterieel</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning en andere bedrijven.</td></tr><tr><td>12 Well Chamber slide, verwijderbaar</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Ook verkrijgbaar bij Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific en anderen</td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuizen</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>3D Petri Schaal micromalen</td><td>Microtissue</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6 well cell-cultuur platen, sterieel</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Commercieel verkrijgbare gecoate 96-well plate voor sfeervorming</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Gebruik in verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimension software</td><td>Olympus</td><td>versie 3</td><td></td></tr><tr><td>Collageen uit menselijke placenta, type IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Voor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven</td></tr><tr><td>Confocale FLIM Microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falcon geïnverteerde microscoop met wit-licht laser, HyD X detectoren, klimaat / T controlekamer (OkoLab), 25x/0.95 W objectief</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Bereid 1 M stockoplossing, 1:100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)</td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), fenolrood-, glucose-, pyruvaat- en glutamine-vrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Voor bereiding van beeldvormingsmedium</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum&nbsp;(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Ook verkrijgbaar bij Sigma. Moet voor gebruik warmte-inactivering ondergaan.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)</td></tr><tr><td>Menselijk colonkanker cellen HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>versie 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>versie 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, noodzakelijk om 1 mM Natrium Pyruvaat en 10 mM HEPES toe te voegen</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Standaard groeimedium voor HCT116 cellen</td></tr><tr><td>Micro-gepattered 3D-geprinte PDMS stempels</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Verstrekt door het Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universiteit Gent</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer telkamer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>O2 sondes: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Volledige karakterisering, validatie en enkele toepassingen zijn te vinden op: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Los PBS tablet op in 500 mL gedistilleerd water.</td></tr><tr><td>Pen Strep :Penicilline (10.000 U/mL) / streptomycine (10.000 &mu;g/mL) 100x oplossing</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Voor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Celdoodkleuring, gebruik 1 &micro;g/mL bij 1h incubatie</td></tr><tr><td>PVDF spuitfilter 0,22 &micro;m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 1mM)</td></tr><tr><td>SphericalPlate 5D 24-well</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>Steriele petrischaal</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>Weefselcultuur fles (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>Weefselcultuur fles (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven</td></tr><tr><td>U-bodem 96-well plaat</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one en andere bedrijven</td></tr><tr><td>Ultrapuur Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Andere soorten Agarose zoals Agarose met laag smeltpunt

productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (flim) van meercellige sferoïden

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Meercellige tumorsferoïden zijn een populair 3D-weefselmicroaggregaatmodel voor het reproduceren van tumormicro-omgevingen, het testen en optimaliseren van medicamenteuze therapieën en het gebruik van bio- en nanosensoren in een 3D-context. Hun productiegemak, voorspelbare grootte, groei en waargenomen nutriënten- en metabolietgradiënten zijn belangrijk om de 3D-niche-achtige celmicro-omgeving samen te vatten. Sferoïde heterogeniteit en variabiliteit van hun productiemethoden kunnen echter het algehele celmetabolisme, de levensvatbaarheid en de geneesmiddelrespons beïnvloeden. Dit maakt het moeilijk om de meest geschikte methodologie te kiezen, rekening houdend met de vereisten in grootte, variabiliteit, behoeften van biofabricage en gebruik als in vitro 3D-weefselmodellen in de stam- en kankercelbiologie. In het bijzonder kan de productie van sferoïde invloeden van invloed zijn op hun compatibiliteit met kwantitatieve levende microscopieën, zoals optische metabole beeldvorming, fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM), monitoring van sferoïde hypoxie met nanosensoren of levensvatbaarheid. Hier worden een aantal conventionele sferoïde vormingsprotocollen gepresenteerd, waarbij hun compatibiliteit met de live widefield-, confocale en twee-foton-microscopieën wordt benadrukt. De follow-up beeldvorming tot analysepijplijn met gemultiplexte autofluorescentie FLIM en, met behulp van verschillende soorten kanker en stamcelsferoïden, wordt ook gepresenteerd.

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Fluorescentie Lifetime Imaging (FLIM) heeft zich ontpopt als een belangrijke techniek om het imago van de omgeving en de interactie van specifieke eiwitten en kleurstoffen in levende cellen. FLIM van fluorescerende moleculaire rotoren laat in kaart brengen van de viscositeit in levende cellen.

Fluorescentie Lifetime Imaging voor Moleculaire Rotoren in levende cellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Leer de productie van meercellige sferoïden voor live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM). Deze methode analyseert celmetabolisme en zuurstofverdeling in 3D-modellen.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Meer video's verkennen