Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden
9 augustus 2024
Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.
In dit werk presenteren en vergelijken we sferoïde vormingsmethoden die kunnen worden gebruikt voor analyse van celmetabolisme en zuurstofverdeling met behulp van levende celmicroscopie. In de afgelopen jaren is fluorescentiebeeldvormingsmicroscopie op grote schaal gebruikt om metabole biomarkers zoals NADPH en FAD in levende cellen te onderzoeken, en er zijn verschillende fluorescerende nanodeeltjes ontwikkeld om dergelijke metingen te multiplexen met beeldvorming van cel- en weefseloxygenatie. Meercellige sferoïden, organoïden en organ-op-een-chip kunnen een complexe, in-vivo-achtige micro-omgeving nabootsen, waardoor de noodzaak in dieronderzoek wordt geminimaliseerd.
Voor de productie van sferoïde tonen we verschillende vormingsmethoden, die kunnen variëren van lage tot hoge doorvoer. Ze benadrukken ook hun optische toegankelijkheid, compatibiliteit met een fluorescentie-levenslange beeldvormingsmicroscoop en de mogelijkheid om extracellulaire matrixcomponenten op te nemen. Dus hoewel 3D in vitro modellen een betere context bieden in vergelijking met 2D-culturen, blijven hun hoge variabiliteit, lage reproduceerbaarheid en onvolledige experimentele rapportage een probleem.
Parameters zoals de sferoïde grootte, de samenstelling van de voedingsstoffen, de extracellulaire viscositeit en zelfs sferoïde vormingsmethoden kunnen allemaal leiden tot verhoogde cellulaire heterogeniteit. Met dit protocol willen we de productiemethoden van sferoïde harmoniseren en standaardiseren, waarbij we de belangrijkste aspecten benadrukken die belangrijk zijn voor levenscontinue en multiparametrische analyse van sferoïden met behulp van FLIM-microscopie.
Overzicht
Dit artikel presenteert verschillende methoden voor het vormen van multicellulaire sferoïden om het celmetabolisme en de zuurstofdistributie te analyseren met behulp van live-cell microscopie. De studie benadrukt het gebruik van fluorescentie-levetijdsbeeldvormingsmicroscopie (FLIM) om metabole biomarkers in levende cellen te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Live cell imaging
Achtergrond
- Multicellulaire sferoïden en organoïden bootsen in-vivo-achtige micro-omgevingen na.
- Fluorescentielevensduur-imaging microscopie wordt gebruikt om metabole biomarkers te bestuderen.
- Hoge variabiliteit en een lage reproduceerbaarheid zijn uitdagingen bij 3D in vitro modellen.
- Verschillende methoden voor de vorming van sferoïden kunnen worden ingezet voor diverse toepassingen.
Doel van de studie
- Om methoden voor de vorming van sferoïden voor live-cell microscopie te vergelijken.
- Om het celmetabolisme, hypoxia en celdood in 3D-modellen te analyseren.
- Om het begrip van de zuurstofdistributie in multicellular systemen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fluorescentie-levtijdbeeldvormingsmicroscopie (FLIM)
- Analyse van cellulaire autofluorescentie
- Gebruik van kleurstoffen en fluorescerende nanodeeltjes
- Verschillende technieken voor sferoïdevorming
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde methoden voor het analyseren van het celmetabolisme in 3D-sferoïden.
- Toonde de compatibiliteit van sferoïden met FLIM aan voor metabole studies.
- Benadrukte het belang van componenten van de extracellulaire matrix bij de vorming van sferoïden.
- Behandelde uitdagingen op het gebied van reproduceerbaarheid en variabiliteit van 3D-culturen.
Conclusies
- Verschillende methoden voor sferoïdevorming kunnen de analyse van levende cellen verbeteren.
- FLIM biedt waardevolle inzichten in metabole processen in 3D-modellen.
- Voortdurende ontwikkeling van deze methoden kan de afhankelijkheid van diermodellen verminderen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Gestandaardiseerde productie en multi-parameter FLIM-analyse van multicellulaire sferoïden pakken kritieke uitdagingen aan bij het modelleren van tumormicro-omgevingen voor geneesmiddelenontwikkeling. Het harmoniseren van sferoïdevorming en workflows voor live-cell imaging verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van metabolische en hypoxie-gerelateerde read-outs, wat robuuste besluitvorming in een vroeg stadium ondersteunt. Deze benadering versterkt de translationele continuïteit en vermindert biologische risico's binnen R&D-portfolio's voor oncologie en stamcellen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Maakt analyse van metabole routes en zuurstofgradiënten mogelijk in fysiologisch relevante 3D-modellen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door kwantificering van NADPH- en FAD-biomarkers in levende sferoïden.
- Faciliteert biologische risicoreductie via gemultiplexte metabole en hypoxiemetingen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor target-engagement en routemodulatie in complexe systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Maakt reproduceerbare 3D-sferoïde-modellen die compatibel zijn met widefield-, confocale en tweefoton-FLIM-platformen.
- Standaardiseert assay-condities om variabiliteit te verminderen en de betrouwbaarheid van de kwantitatieve output te verhogen.
- Maakt schaalbare high-throughput screening van effecten van verbindingen op celmetabolisme en levensvatbaarheid mogelijk.
- Ondersteunt een robuuste evaluatie van de integratie van bio- en nanosensoren voor gemultiplexte read-outs.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro metabole en hypoxieprofielen met ziekterelevante tumormicro-omgevingen.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de afhankelijkheid van diermodellen te minimaliseren.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve, multiparametrische gegevens.
- Faciliteert de ontwikkeling van translationele biomarkers met behulp van live-cell FLIM-outputs.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze geharmoniseerde workflow integreert de fasen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van gestandaardiseerde sferoïdeproductie en FLIM-analyses.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in 3D, in vivo-achtige contexten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve metabolische en hypoxie-read-outs voor de triage van verbindingen.
- Analytics: Biedt gemultiplexte fluorescentielevensduurmetingen voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen door kenmerken van de tumormicro-omgeving te recapaculeren.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor diverse oncologie- en stamcel-R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in 3D-modelsystemen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van live-cell imaging-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste, kwantitatieve gegevens.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling mogelijk van kandidaten met een gevalideerde biologische relevantie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek, live-cell microscopie en FLIM-analyse.
- Vereist toegang tot widefield, confocale of tweefoton FLIM-instrumentatie en compatibele analysesoftware.
- Vraagt om cross-team standaardisatie van sferoïdeproductie en beeldgevingsprotocollen.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende celtypen, extracellulaire matrices of sensorintegratie.
- Variabiliteit in sferoïdegrootte en -samenstelling kan de reproduceerbaarheid en datainterpretatie beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
