Name: Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Leer een geoptimaliseerde collageenase-perfusietechniek voor de isolatie van primaire hepatocyten uit rattenlever. Deze methode maakt succesvolle 3D-organoïdecultuur mogelijk voor langetermijnonderzoek naar leverfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
<li>Ietto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+liver+organoids%3A+Generation+and+importance+of+diverse+specialized+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components.</a> Cells. 12 (10), 1429(2023).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+in+collagen+sandwich%3A+evidence+for+transcriptional+and+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation.</a> J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).</li>
<li>Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Hepatocytes+in+sandwich+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Primary Hepatocytes in sandwich culture.</a> Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hepatocyte+isolation+and+cultures%3A+Technical+aspects%2C+challenges+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements.</a> Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).</li>
<li>Thompson, W. L., Takebe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+model+systems+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Human liver model systems in a dish.</a> Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+organoids+are+a+powerful+tool+for+the+study+of+liver+disease+and+personalized+treatment+design+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).</li>
<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
<li>Peng, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokine+TNFalpha+promotes+the+long-term+expansion+of+primary+hepatocytes+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLancaster%2C+MA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> J Vis Exp. (132), e56993(2018).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PREPARE%3A+Guidelines+for+planning+animal+research+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing.</a> Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).</li>
<li>Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+murine+primary+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

```html
<table><tbody><tr><td>A83-01- ALK5 Inhibitor IV</td><td>Twin Helix</td><td>&nbsp;T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System&nbsp;</td><td>&nbsp;Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 imaging kit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Collagen, Type I, solution from rat tail</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp;E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natrium 25000 IE/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrine-Selenium oplossing 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine oplossing</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Lever Digest Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp;17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Lever Perfusie Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteïne</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Merck</td><td>&nbsp;N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Niet-Essentiële Aminozuren</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine oplossing 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Ismatec&trade;&nbsp;</td><td>MS-4/12 Reglo Digital Pump</td><td></td></tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tubing&nbsp;</td><td>Ismatec&trade;&nbsp;</td><td>&nbsp;ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, geen glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>
```

perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3d-organoïdencultuur

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

rat-liver-perfusion-primary-hepatocytes-isolation-an-old-procedure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

De studie van de lever sinusoïdale endotheelcellen (SEC) moeten worden uitgevoerd met primaire cellen afkomstig van het dier als geen cel-lijnen bestaan. Deze methode is gebaseerd op de lever spijsvertering en differentiële centrifugatie voor SEC zuivering voor latere kweken en experimenteren.

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.

Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen

Leer een geoptimaliseerde collageenase-perfusietechniek voor de isolatie van primaire hepatocyten uit rattenlever. Deze methode maakt succesvolle 3D-organoïdecultuur mogelijk voor langetermijnonderzoek naar leverfunctie.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur (Video) | JoVE Journal

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Meer video's verkennen