Name: Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryos: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer een protocol voor single-cell RNA-sequencing van gastrulerende muizenembryo's met lineage-mutaties. Deze methode genereert hoogwaardige datasets voor analyse van vroege celbeslissingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen de Genomics Core van het Fox Chase Cancer Center en de leden van het Dr. Johnathan Whetstine-laboratorium, Zach Gray, Madison Honer en Benjamin Ferman, voor de technische ondersteuning van de sequentie-experimenten. We erkennen laboratoriumleden van Dr. Estaras en Alex Morris, een rotatiestudent die heeft bijgedragen aan de eerste analyse van de eencellige studies. Dit werk wordt gefinancierd door de NIH-subsidies R01HD106969 en R56HL163146 aan Conchi Estaras. Bovendien werd Elizabeth Abraham ondersteund door T32-opleidingsbeurs 5T32HL091804-12.

Isolatie en genotypering van gastrollerend muizenembryo voor single-cell sequencing

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel wordt een robuuste pijplijn gepresenteerd voor het verkrijgen van hoogwaardige eencellige en kernsuspensies uit gastrulerende muizenembryo's, speciaal ontworpen om studies naar mechanismen van cel-lotspecificatie in vroege ontwikkeling te vergemakkelijken. Deze methode pakt een cruciale leemte op het gebied van gastrulatie aan door de analyse van embryo's die genotypen vereisen, zoals geslacht of somatische genen, te optimaliseren. Door gebruik te maken van genetische mutatie muismodellen en gebruik te maken van eencellige sequencing met hoge resolutie op hele muizenembryo's, kan deze pijplijn het begrip van de genexpressieprofielen van de vroege muizengastrula verder verbeteren. Deze methode toont de haalbaarheid aan van het gebruik van een genetisch mutatiemuismodel door een Cre-recombinasesysteem om cellen en kernen van hoge kwaliteit te verkrijgen op vroege ontwikkelingstijdstippen voor single-cell omics. Deze methode evolueerde door middel van meerdere pogingen, waarbij de steekproeven niet voldeden aan de kwaliteitsnormen die vereist zijn voor de voorbereiding en volgorde van de bibliotheek. De uitgelegde methodologie genereert voldoende cellen/kernen van embryo's jonger dan E8 door de optimalisatie van drie kritieke stappen: (1) gesynchroniseerde getimede zwangerschappen om het aantal embryo's te vergroten, (2) genotypering op dezelfde dag om bevriezing/ontdooiing te voorkomen, en (3) het beoordelen van de levensvatbaarheid van cellen/kernen om sequencing van stervende cellen te voorkomen. Dit protocol levert succesvolle resultaten op met single-cell RNASeq, maar de cel- of kernsuspensies die in dit protocol worden verkregen, kunnen worden verwerkt in andere sequencingplatforms, waar de levensvatbaarheid van cellen de beperkende factor is, zoals smart-seq, drop-seq en cel-seq16.
Bij het E7-embryo kan het aantal cellen variëren, afhankelijk van de stam en het mutante genotype. Doorgaans kan een E7-embryo variëren van honderden tot een paar duizend cellen, en het verkrijgen van embryo's met het gewenste genotype is een uitdaging, met slechts 1 of 2 embryo's per zwangere moeder die aan de criteria voldoen. Dit protocol maakt het mogelijk om ongeveer 300 levensvatbare cellen per E7-embryo vast te leggen voor analyse van één cel. Pogingen om de grootte van de embryopool te vergroten door embryo's van zwangere moederdieren op verschillende dagen in te vriezen, bleken niet succesvol, omdat de levensvatbaarheid van de cellen na ontdooien ernstig in het gedrang kwam, zelfs met de toevoeging van cryopreservatiemiddelen. Om deze uitdaging aan te gaan, werd de fokstrategie en synchronisatie van drachtige moederdieren geoptimaliseerd. Om de kans op meerdere isolaties te vergroten, wordt aanbevolen om vrouwelijke muizen te gebruiken die 1-2 keer zijn bevallen voordat ze voor isolatie worden gefokt, omdat ze meer kans hebben op grotere worpgroottes. Het monitoren van de oestrische cyclus van het vrouwtje is cruciaal; Paring komt vaker voor tijdens de pro-oestrus- en oestrusstadia. Als er broedproblemen ontstaan, helpt het ook om de kweekpartners na vier dagen te wisselen als er geen plug wordt geproduceerd.
Het is belangrijk op te merken dat deze methode een beperking heeft: het is gebaseerd op waargenomen pluggen, en zelfs als een plug wordt waargenomen, garandeert het geen zwangerschap, maar geeft het alleen seksuele activiteit aan. Daarom zal het verhogen van het aantal waargenomen pluggen op een dag de kans vergroten dat er meer dan één drachtige moeder op een dag en meer positieve genotypen zijn. Dit protocol toonde de haalbaarheid aan van het gebruik van embryonale stadia variërend van E7 tot E7.75 als een proof of concept tijdens gastrulatie. Deze pijplijn kan echter worden toegepast van E6.5 tot E8 embryo's. Voor E6.5-embryo's wordt aanbevolen om het aantal gesynchroniseerde zwangerschappen te verhogen om ten minste 7 embryo's met het gewenste genotype te verkrijgen. Verhoog in plaats daarvan voor de E8-embryo's de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt om elk embryo te dissociëren tot ~ 40 μL in plaats van 20 μL. Het doel is om een cel/kernsuspensie te verkrijgen in een concentratiebereik van 700-1200 cellen per μl voordat wordt overgegaan tot de partitionering.
Een goede levensvatbaarheid van cellen is essentieel voor het succes van sequencing van één cel. In het microfluïdische chipontwerp dat door de fabrikanten wordt geleverd, worden afzonderlijke cellen verdeeld in gelparels-in-emulsie (GEM's) in een chip die bekende gelkorrels met streepjescode bevat11. Een opmerkelijke beperking van dit proces is echter dat zowel afzonderlijke cellen van hoge als slechte kwaliteit kunnen worden gepartitioneerd. Zelfs met een voldoende aantal levende cellen (d.w.z. 1000 cellen/μL), als de levensvatbaarheid van de suspensie laag is (d.w.z. 1000 levende cellen en 1000 cellen dood, wat resulteert in 50% levensvatbaarheid), zal het sequencing-experiment waarschijnlijk mislukken. Voor een optimaal resultaat wordt aanbevolen om te streven naar een levensvatbaarheid van ongeveer 90%. Als de levensvatbaarheid van de cel tussen ongeveer 60%-89% daalt, kunnen specifieke maatregelen worden genomen om de levensvatbaarheid van het experiment te verbeteren. Als de levensvatbaarheid van de cel echter minder dan 60% is, wordt het ten zeerste afgeraden om door te gaan met het experiment. De reden hiervoor is dat de stervende cellen worden 'gevangen' in de partitioneergel en dat de daaropvolgende bibliotheekvoorbereiding en kwaliteitscontroles zonder merkbare problemen zullen verlopen. Het eigenlijke sequencing-experiment kan echter volledig mislukken, aangezien de meeste sequencing-metingen mitochondriale, ribosomale of apoptose-genen in kaart zullen brengen, wat vanaf het begin tekenen van slechte cellevensvatbaarheid aangeeft. De gegevens in dit artikel illustreren een pijplijn voor eencellige sequencing van gastrulerende muizenembryo's met cellen van hoge kwaliteit. Deze methodologie kan worden toegepast voor het begrijpen van veel verschillende genetische mutatie muismodellen tijdens de ontwikkeling.

Gastrulatie is een fundamenteel proces dat nodig is voor een normale ontwikkeling. Dit snelle en dynamische proces vindt plaats wanneer pluripotente cellen overgaan in afstammingsspecifieke voorlopers die bepalen hoe organen worden gevormd. Jarenlang werd gastrulatie lang gedefinieerd als de vorming van drie grotendeels homogene populaties: mesoderm, ectoderm en endoderm. Technologieën met een hoge resolutie en een opkomend aantal embryonale stamcelmodellen 1,2 onthullen echter een ongekende heterogeniteit tussen de vroege kiemlagen 3,4. Dit suggereert dat er nog veel meer moet worden ontdekt over de mechanismen die de verschillende celpopulaties van de gastrula reguleren. De embryonale ontwikkeling van muizen is een van de beste modellen geweest om vroege beslissingen over het lot van cellen tijdens gastrulatie te bestuderen 3,5. Gastrulatie bij muizen is snel, aangezien het hele proces van gastrulatie binnen 48 uur plaatsvindt, van embryonale dag E6.5 tot E85.
Recente ontwikkelingen in eencellige technologieën hebben het mogelijk gemaakt om de embryonale ontwikkeling van wildtype muizen gedetailleerd in kaart te brengen, waardoor een uitgebreid overzicht wordt gegeven van de cellulaire en moleculaire landschappen van embryo's tijdens gastrulatie 3,4,6,7,8. De analyse van mutante embryo's in deze stadia komt echter minder vaak voor en is vaak beperkt tot FACS-gesorteerde populaties 9,10. De schaarse literatuur weerspiegelt de technische uitdagingen die gepaard gaan met de manipulatie en eencellige voorbereiding van gastrulerende embryo's die genotypering vereisen. Het vastleggen van het dynamische proces van gastrulatie kan uitdagingen opleveren vanwege de snelle aard ervan, vooral voor het begrijpen van mutante embryo's. De timing en synchronisatie van zwangerschappen zijn essentieel, omdat zelfs kleine verschillen tussen getimede zwangerschappen verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd als een ontwikkelingsfenotype dat het gevolg is van het gemuteerde gen. Dit wordt vooral belangrijk wanneer het gemuteerde gen het proces van gastrulatie beïnvloedt13,14. In deze studie worden richtlijnen opgesteld om gesynchroniseerde zwangerschappen te verkrijgen door visualisatie van vaginale pluggen (d.w.z. de massa gecoaguleerde zaadvloeistof die na de paring in de vagina van het vrouwtje wordt gevormd). Daarnaast is er een strategie ontworpen om robuuste eencellige gegevens te verkrijgen van mutante gastrulerende embryo's van E6.5 tot E8. Deze strategie is ontworpen om de beperkingen te overwinnen die verband houden met het lage aantal embryo's met het gewenste genotype per zwangerschap en de afname van de levensvatbaarheid veroorzaakt door het invriezen en ontdooien van embryo's of cellen.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methodologie van het tot stand brengen van getimede zwangerschappen via vaginale pluggen tot de uiteindelijke sequentiebepaling van individuele cellen/kernen. Deze methode legt uit hoe het aantal gesynchroniseerde zwangerschappen kan worden verhoogd om een groter aantal embryo's met het gewenste genotype te verkrijgen, cel-/kernisolaties om de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren en een genotyperingsprotocol op dezelfde dag. Dit manuscript beschrijft ook het proces van embryo-isolatie op verschillende gastrulatietijdstippen. De methodologie helpt om het aantal uiteindelijk levensvatbare embryocellen/-kernen voor sequencing te verhogen, waardoor sequencinggegevens van hoge kwaliteit worden gegarandeerd. Daarom zal deze methode de deuren openen voor eencellige studies van gastrulerende embryo's die genotypering vereisen.

<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dish</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro;L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro;m Reversible Strainer, small</td><td>Stem Cell</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petri dish</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8-strip PCR tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR yolk sac</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Imaging System</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free Water</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Optical Tube 8x Strip (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Optical Tube Cap 8x Strip (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Quantification Assay Kits</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tape Station Loading tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Quality Biological</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell rna-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

In het afgelopen decennium zijn single-cell-benaderingen de gouden standaard geworden voor het bestuderen van de dynamiek van genexpressie, celheterogeniteit en celtoestanden in monsters. Vóór de vooruitgang van eencellige cellen was de haalbaarheid van het vastleggen van het dynamische cellulaire landschap en snelle celovergangen tijdens de vroege ontwikkeling beperkt. In dit artikel is een robuuste pijplijn ontworpen om eencellige en kernanalyse uit te voeren op muizenembryo's van embryonale dag E6.5 tot E8, wat overeenkomt met het begin en de voltooiing van gastrulatie. Gastrulatie is een fundamenteel proces tijdens de ontwikkeling dat de drie kiemlagen vastlegt: mesoderm, ectoderm en endoderm, die essentieel zijn voor organogenese. Er is uitgebreide literatuur beschikbaar over single-cell omics toegepast op wild-type perigastrulating embryo's. Analyse van eencellige cellen van gemuteerde embryo's is echter nog steeds schaars en vaak beperkt tot FACS-gesorteerde populaties. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de technische beperkingen die verband houden met de noodzaak van genotypering, getimede zwangerschappen, het aantal embryo's met de gewenste genotypen per zwangerschap en het aantal cellen per embryo in deze stadia. Hier wordt een methodologie gepresenteerd die is ontworpen om deze beperkingen te overwinnen. Deze methode stelt fok- en getimede zwangerschapsrichtlijnen vast om een grotere kans op gesynchroniseerde zwangerschappen met de gewenste genotypen te bereiken. Optimalisatiestappen in het embryo-isolatieproces in combinatie met een genotyperingsprotocol op dezelfde dag (3 uur) maken het mogelijk om op microdruppels gebaseerde single-cell op dezelfde dag uit te voeren, waardoor de hoge levensvatbaarheid van cellen en robuuste resultaten worden gegarandeerd. Deze methode omvat verder richtlijnen voor optimale kernisolaties van embryo's. Deze benaderingen vergroten dus de haalbaarheid van eencellige benaderingen van mutante embryo's in het gastrulatiestadium. We verwachten dat deze methode de analyse zal vergemakkelijken van hoe mutaties het cellulaire landschap van de gastrula vormgeven.

De methodologie die in dit artikel is ontworpen, is specifiek bedoeld om de voorbereiding van embryomonsters voor single-cell omics van E6.5 tot E8 te verbeteren. Deze robuuste pijplijn bestaat uit vijf belangrijke stappen: gesynchroniseerde getimede zwangerschappen, embryo-isolaties, genotypering op dezelfde dag, celdissociatie en beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen (Figuur 1A). Hoewel de gepresenteerde gegevens zich richten op tijdstippen van E7 tot E7.5, kunnen ze worden toegepast op embryo's tot E8 (Figuur 1B) met kleine variaties in de procedure (verwezen naar opmerkingen in het hele protocol). Gesynchroniseerde getimede zwangerschappen werden bereikt door twee vrouwelijke muizen in een kooi met een mannelijke muis te plaatsen. Vaginale pluggen werden elke ochtend voor 10 uur gecontroleerd en als er een plug werd waargenomen, werd deze tegen het middaguur van die dag als E0,5 beschouwd (Figuur 2A). In deze studie vereisten de optimale omstandigheden voor pluggen dat een vrouwelijke muis in het oestrus- of pro-oestrusstadium werd gekoppeld aan een mannetje met een geschiedenis van het succesvol plaatsen van meerdere pluggen tijdens eerdere kweek (Figuur 2B). Alleen voor de hand liggende pluggen werden overwogen voor embryo-isolaties (Figuur 2C).
De timing van de ontwikkeling werd geschat volgens het tijdschema in figuur 2A. Voor E7.5 begon de embryodissectie om 12 uur op de 7edag volgend op de dag van de detectie van een plug. Figuur 3 illustreert een succesvolle embryo-isolatie bij E7.5. Nadat de zwangere moeder was geëuthanaseerd, werd de baarmoederhoorn ontleed, werd de deciduale zwelling afzonderlijk gesneden, waardoor het embryo zichtbaar werd, en werd de dooierzak geïsoleerd voor genotypering (Figuur 3).
Genotypering op dezelfde dag werd uitgevoerd binnen 3 uur na isolatie van het embryo volgens de stappen in figuur 4A. De embryo's werden tijdens het genotyperingsproces op het ijs gehouden om hun integriteit te behouden. Vries de embryo's niet in, omdat dit het aantal levensvatbare cellen per embryo zal verminderen. Figuur 4B,C toont de viscerale dooierzak, de pariëtale endodermale zak en de ectoplacentale kegel met bijbehorend bloed van de moeder. De viscerale dooierzak werd gebruikt voor genotypering (Figuur 4C). Na het verteren van de dooierzak werd de PCR-mix bereid en werd de PCR-reactie uitgevoerd. Het resulterende PCR-product werd vervolgens gescheiden op een agarosegel. Figuur 4D toont de verwachte fragmentgroottes voor de LoxP- en wildtype allelen (respectievelijk 597 bp en 498 bp) en het Cre-allel (650 bp). In figuur 4E wordt een voorbeeld gegeven van genotypering van de dooierzak van 6 embryo's verkregen uit fokparen die Cre- en LoxP (flox) allelen dragen. De gels geven de PCR-producten van de Cre- en LoxP-allelen weer in de 6 geanalyseerde embryo's. Embryo's nummer 2 en nummer 5 dragen 2 flox-allelen en 1 cre-allel; daarom worden ze beschouwd als voorwaardelijke KO-embryo's (Figuur 4E, rode stippen). Embryo's 1 en 3 hebben 2 flox-allelen, maar zijn negatief voor Cre; Daarom worden ze beschouwd als flox-controles. Embryo 4 heeft 2 flox allelen en een vage band voor het Cre-allel, wat resulteert in een "onduidelijk" genotype. Dit embryo werd niet verder verwerkt (als alternatief kan de experimentalist overwegen de genotypering te herhalen of een secundaire validatie van de voorwaardelijke KO uit te voeren met behulp van cellen die Cre tot expressie brengen). Het is belangrijk op te merken dat de Cre-driver die in dit experiment wordt gebruikt, niet tot uiting komt in de viscerale dooierzak15; daarom lijken de LoxP-allelen niet verschoven op de gel van Cre-positieve embryo's in vergelijking met de Cre-negatieve.
Celgetal en een goede levensvatbaarheid zijn vereist voor een succesvol eencellig experiment. Suspensies met een lage levensvatbaarheid van de cellen, een hoog percentage dode cellen, klontering of veel vuil zijn ongeschikt voor verdere verwerking. Optimale omstandigheden zijn voor 700-1200 levende cellen per microliter en >90% levensvatbaarheid. Figuur 5A toont een paneel dat zowel de goede als de suboptimale levensvatbaarheid van cellen illustreert. Dezelfde criteria kunnen ook worden toegepast voor de isolatie van kernen, zoals weergegeven in figuur 5B. Het is echter van cruciaal belang op te merken dat de evaluatie van trypanblauw verschilt van cellen en kernen: levensvatbare cellen bevatten geen trypanblauw, terwijl levensvatbare kernen dat wel doen. Als de suspensie van cellen/kernen optimaal is (>90% levensvatbaarheid), ga dan verder met de partitionering van één cel met behulp van een microfluïdische chip volgens de procedures van de fabrikant11. Er zijn opties voor probleemoplossing beschikbaar voor suspensies waarbij de levensvatbaarheid van cellen/kernen tussen 60%-89% ligt, zoals weergegeven in figuur 5C. Als de levensvatbaarheid, ongeacht het totale aantal cellen, onder de 60% daalt, overweeg dan om het experiment stop te zetten.
De hele pijpleiding van het ruimen van de zwangere dam tot de bouw van de bibliotheek duurt in totaal 8 uur op dezelfde dag (d.w.z. protocolstappen 2 tot en met 6 moeten op dezelfde dag worden uitgevoerd). Volgens de procedures die zijn uiteengezet in de procedures van de fabrikanten van eencellige cellen11, werden bibliotheekconstructies voorbereid voor sequencing van eencellig RNA met behulp van cellen verkregen uit E7-embryo's, met een cellevensvatbaarheid variërend van suboptimale tot optimale omstandigheden, met als doel een geschat doelherstel van 2000 cellen (Figuur 6). Figuur 6A toont een representatieve fragmentgrootteverdeling van scRNAseq-bibliotheken voor zowel suboptimale als optimale omstandigheden, wat aangeeft dat de levensvatbaarheid van cellen geen significante invloed heeft op het gehele partitioneringsproces van één cel. De verdeling van de fragmentgrootte varieerde tussen 400-500 bp. Dit geeft aan dat suboptimale omstandigheden geen invloed hebben op het proces van bibliotheekvoorbereiding. Figuur 6B toont de uitkomsten van zowel succesvolle als suboptimale single-cell RNAseq experimenten. Na sequencing werden kwaliteitscontroles uitgevoerd op monsters en werd vastgesteld dat, in gevallen waarin de levensvatbaarheid van de cellen niet optimaal was, slechts 10% van de cellen met succes werd gesequenced. Daarentegen vertoonden optimale monsters een hoger percentage, waarbij 91% van het totale aantal cellen werd gesequenced. Dit wordt verder bewezen door barcodeplots, die aangeven dat de suboptimale omstandigheden een grotere achtergrondruis hebben in vergelijking met optimale omstandigheden. Voor beide experimenten werd een clusteranalyse uitgevoerd en deze onthulde 9 clusters in de optimale omstandigheden en 4 in de suboptimale. Annotatie van de clusters met behulp van bekende markers3 onthulde verwachte celtypen in de E7-embryo's, waaronder epiblast en primitieve streak (Figuur 6B). Clusterannotaties in het suboptimale experiment waren niet mogelijk vanwege het gebrek aan verrijking in bekende markers voor elk cluster. Dit benadrukt het belang van cellen van hoge kwaliteit die nodig zijn voor de juiste weergave van gegevens tijdens deze ontwikkelingsstadia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Figuur 1: Optimalisatie van het gastruleren van hele muizenembryo's voor single-cell RNA sequencing. (A) Werkstroomschema voor het verkrijgen van cellen en/of kernen van hoge kwaliteit uit gastrulerende embryo's. (B) Representatieve heldere veldbeelden en aangepast schema3 van muizenembryo's tijdens gastrulatie van E7 tot E8. Schaalbalk: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Figuur 2: Strategie voor efficiënte gesynchroniseerde getimede zwangerschappen voor embryo-isolaties tijdens gastrulatie. (A) Schematisch diagram dat de pijplijn voor getimede zwangerschappen aangeeft en een tijdschema dat de tijden beschrijft van plugdetectie tot embryo-isolatie voor analyse van specifieke gastrulatiefasen. (B) Representatieve beelden van de fasen van de oestruscyclus voor vrouwelijke muizen. De fasen die het meest ontvankelijk zijn voor de fokkerij worden aangegeven. (C) Schematisch diagram dat illustreert hoe te controleren op vaginale pluggen en voorbeelden van vaginale openingen zonder plug, een gedeeltelijke plug of een goede plug om te overwegen voor embryo-isolaties. Onder elke afbeelding wordt ingezoomd op de vaginale openingen. De plug (gestold sperma in de vaginaopening) is gemarkeerd met een rode pijl die ernaar wijst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Figuur 3: Dissectie en genotypering van E7.5-embryo's voor single-cell RNA-sequencing. Schematische diagrammen en afbeeldingen van het proces van het isoleren van E7.5-embryo's en het ontleden van de viscerale dooierzak. De gele pijl geeft de baarmoeder van de drachtige moeder aan en de gele stippellijn schetst de locatie van het embryo. Stippellijnen geven de gebieden weer die tijdens de dissectie zijn gesneden. "M" staat voor het mesoomtriale uiteinde, terwijl "AM" het anti-mesoomtriale uiteinde aangeeft. Schaalbalken in stereoscoopafbeeldingen zijn 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Figuur 4: Genotypering op dezelfde dag van dooierzakjes van gastrulerende muizenembryo's. (A) Werkstroomschema voor genotypering van dooierzakjes op dezelfde dag. (B) Representatief beeld van de pariëtale endodermale zak en de ectoplacentale kegel met geassocieerd maternaal bloed. (C) Viscerale dooierzak in E7.5-embryo's gemarkeerd door de stippellijn. Schaalbalk: 200 μm. (D) Representatieve gels van wildtype (+/+), heterozygoot (Flox/+) en homozygoot flox (Flox/Flox), en Cre-genotypering (Mesp1cre15) met waargenomen DNA-fragmentgroottes. (E) Genotyperingsresultaten op dezelfde dag voor Cre- en flox-allelen uit dooierzakjes van 6 embryo's (1-6) worden verstrekt. De twee embryo's met flox/flox- en Cre-negatieve (-) genotypering zijn flox-controles (blauwe stippen), terwijl die met flox/flox- en Cre-positieve (+) genotypering voorwaardelijke KO's (rode stippen) zijn. Embryo 4 is niet optimaal door de zwakke Cre-band (flox/flox en Cre-onduidelijk) en is daarom uitgesloten van verdere verwerking. Embryo's met hetzelfde genotype worden samengevoegd en verwerkt voor single-cell RNA-sequencing. Merk op dat de aanwezigheid van het Cre-allel in de dooierzak geen invloed heeft op de grootte van de floxbanden , aangezien de gebruikte Cre (Mesp1cre) niet tot uiting komt in de dooierzak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Figuur 5: Beoordeling van de celkwaliteit en de levensvatbaarheid van de celkernen. (A) Representatieve beelden van optimale en suboptimale levensvatbaarheidsomstandigheden van cellen van E7.5-embryo's. (B) Representatieve beelden van optimale en suboptimale levensvatbaarheidsomstandigheden van kernen van E8-embryo's (C) Probleemoplossingsschema dat mogelijke oplossingen aangeeft om de levensvatbaarheid van cellen te helpen vergroten voordat met de partitionering van eencellige cellen wordt begonnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Figuur 6: Single-cell RNA-sequencing van E7-muizenembryo's. (A) Representatief spoor van fragmentgrootteverdeling voor single-cell RNA-sequencingbibliotheken van E7-muizenembryo's voor zowel suboptimale als optimale omstandigheden van cellevensvatbaarheid, met de belangrijkste piek in de buurt van 400-500 bp. Merk op dat de sporen tussen deze omstandigheden vergelijkbaar zijn, wat aangeeft dat de levensvatbaarheid van de cel geen invloed heeft op de kwaliteitscontroles van de bibliotheek. (B) Analyse van eencellige RNA-sequencingresultaten voor E7-muizenembryo's onder zowel suboptimale als optimale omstandigheden, waarbij waargenomen doelherstel, barcoderangschikking en clustering van celtypen worden aangetoond door middel van uniforme variëteitsbenadering en projectie (UMAP) distributie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Lysis Buffer</td>
		</tr><tr><td>Naam reagens</td>
			<td>Concentratie van de voorraad</td>
			<td>Uiteindelijke concentratie</td>
			<td>Totaal volume 1 ml</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 m boven NN</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 miljoen</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 miljoen</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Tween-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Nondiedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonine</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>DTT</td>
			<td>1 m boven NN</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>RNase-remmer</td>
			<td>40 E/μL</td>
			<td>1 E/μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer wassen</td>
		</tr><tr><td>Naam reagens</td>
			<td>Concentratie van de voorraad</td>
			<td>Uiteindelijke concentratie</td>
			<td>Totaal volume 1 ml</td>
		</tr><tr><td>BSA bij PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Isolatie van kernen, lysisbuffer en samenstelling van de wasbuffer.

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Leer een protocol voor single-cell RNA-sequencing van gastrulerende muizenembryo's met lineage-mutaties. Deze methode genereert hoogwaardige datasets voor analyse van vroege celbeslissingen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Meer video's verkennen