Name: Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Ontdek een in vitro embryo-implantatiemodel voor reproductieve biologie met muizenembryo's en endometriale cellijnen. Deze methode onthult hoe oestrogeen en progesteron implantatie beïnvloeden en biedt inzichten voor IVF-behandelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onze studies werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82171603), de Foundation of Shanghai Municipal Health Commission (202140341), de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (23JC1403803) en het Innovation Promotion Program van NHC en Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

Het hanteren van muizen en experimentele studies werden uitgevoerd volgens protocollen die waren goedgekeurd door het Animal Committee van het Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies. Zorg voor veiligheidsprocedures: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren van chemicaliën of biologische materialen.
1. Verwerving van muizenembryo's
OPMERKING: In dit gedeelte wordt het proces van het verkrijgen van muizenembryo's beschreven. Volwassen vrouwelijke muizen (6-8 weken oud, hybride C57BL/6 en DBA/2) werden onderhouden onder standaard omgevingsomstandigheden van 12 uur licht en 12 uur donker bij 20-25 °C en een luchtvochtigheid van 40-60%, waarbij voedsel en water ad libitum werden verstrekt.
<ol><li>Injecteer vrouwelijke muizen intraperitoneaal met 10 IE serumgonadotrofine van drachtige merries (PMSG) en vervolgens geïnjecteerd met 10 IE humaan choriongonadotrofine (HCG) met een interval van 42-48 uur.</li>
	<li>Koppel elke vrouwelijke muis aan een mannetje van vergelijkbare leeftijd en controleer de volgende ochtend of er een vaginale plug is. OPMERKING: Vaginale plug is een lichtgele klomp zetpil die wordt gevormd nadat het sperma stolt bij de vaginale opening.</li>
	<li>Euthanaseer de vrouwelijke muizen met vaginale pluggen door CO2 -inhalatie.</li>
	<li>Open de buik en zoek de vrouwelijke geslachtsorganen; rek de eileider, eierstok en vetkussentjes uit met een pincet; knip de eileider en eierstok met een schaar; en snijd vervolgens de eileider en baarmoeder door (Figuur 1).</li>
	<li>Breng de verkregen eileider over in een petrischaal van 35 mm die is voorgevuld met M2-medium. OPMERKING: M2 medium moet worden voorverwarmd in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Prik met een naald van 25 G in de vergrote ampulla van de eileider om het cumulus-zygote-complex los te maken of te knijpen (Figuur 2).</li>
	<li>Gebruik een pincet om het cumulus-zygote-complex over te brengen naar een M2-oplossing met 0,5 mg/ml hyaluronidase en incubeer gedurende enkele minuten totdat de cumuluscellen dissociëren (figuur 3).</li>
	<li>Verzamel de zygoten met behulp van een eiertransferpipet en was ze in M2-medium met 4 mg/ml BSA om resterende hyaluronidase, cumuluscellen en onzuiverheden te verwijderen.</li>
</ol>2. In-vitrocultuur van muizenembryo's
OPMERKING: In dit gedeelte wordt het proces beschreven van het in vitro kweken van muizenembryo's van zygoten tot blastocysten. KSOM kweekmicrodruppels moeten 24 uur van tevoren worden bereid om de temperatuur en het gasevenwicht te garanderen.
<ol><li>Bereid 12 microdruppels KSOM medium, elk met een inhoud van 20 μl, op de bodem van een petrischaal van 35 mm. Bedek de microdruppels met 3-5 ml minerale olie (figuur 4) en plaats de petrischaaltjes in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor evenwicht.</li>
	<li>Breng de muizenembryo's over van M2 medium naar KSOM medium met behulp van een transferpipet voor grondig wassen. OPMERKING: Voor deze stap is een stereomicroscoop met een verwarmingsfase van 37 °C vereist. Minimaliseer de duur van de behandeling van embryo's buiten de couveuse.</li>
	<li>Plaats de gewassen embryo's in de voorbereide KSOM-microdruppels en broed ze gedurende 4 dagen uit bij 37 °C met 5% CO2 . OPMERKING: Om voldoende voeding te garanderen, kweekt u 5-10 embryo's per microdruppel van 20 μL.</li>
	<li>Selecteer voordelige blastocysten op basis van hun grootte (100-130 μm), binnenste celmassa (de binnenste celmassa bestaat uit vele cellen die allemaal samengeperst zijn), aantal trofoblastcellen (de trophectodermis bestaat uit vele cellen die samenhangend en samengepakt zijn) en de mate van expansie (blastocoel beslaat 80-100% van het embryo).</li>
</ol>3. Bereiding van endometriumcellen
<ol><li>Aspireer in een bioveiligheidskast 1 ml 2% gelatine op met behulp van een pipet en doseer deze in een kweekplaat met 12 putjes. Draai de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de bodem volledig bedekt is met de gelatine. Plaats de plaat 30 minuten in een incubator van 37 °C. Zuig daarna de overtollige gelatine op en laat de bodem van de plaat volledig drogen.</li>
	<li>Nadat het coatingproces is voltooid, kweekt u menselijke endometriumadenocarcinoomcellen (Ishikawa) met DMEM/F12 (zie de materiaaltabel voor details), 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml streptomycine en 100 IE/ml penicilline, zaai ze in de met gelatine beklede platen met 12 putjes (2 × 105cellen/putje) en incubeer gedurende 24 uur.</li>
</ol>4. Aanhechting van embryo's
<ol><li>Plaats voorzichtig 5-15 verse blastocysten in elk putje van de plaat met 12 putjes met Ishikawa-cellen die in de vorige stap zijn voorbereid voor co-cultuur (Figuur 5).</li>
	<li>Observeer de embryo's na 48 uur incubatie onder een microscoop om hun aanhechtingsstatus te beoordelen. Om de aanhechting van het embryo te observeren, verplaatst u de plaat snel drie keer. Niet-gehechte embryo's vertonen een zwevende of rollende beweging over het oppervlak van de Ishikawa-cellen.</li>
	<li>Bereken de implantatiesnelheid van het embryo met behulp van vergelijking (1); Gebruik de hechtingssnelheid van het embryo om het implantatie-effect weer te geven. Embryo-implantatiepercentage = (Bijgevoegde embryo's/Totaal aantal geïmplanteerde embryo's) × 100% (1)</li>
</ol>

Evaluatie van embryoadhesie in een in vitro co-cultuurmodel met Ishikawa-cellen

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van financiële of andere belangen te melden.

De eenvoud en snelheid van het voorgestelde in-vitromodel voor embryo-implantatie bieden opmerkelijke voordelen voor het screenen van geneesmiddelen in een vroeg stadium en andere onderzoekstoepassingen. Het eenvoudige protocol, in combinatie met de high-throughput aard van Ishikawa-cellijnen, maakt het een ideale kandidaat voor grootschalige schermen, vooral in de vroege stadia van de ontdekking van geneesmiddelen. Liang13 ontdekte dat TAGLN2 knockdown het invasievermogen van trofoblastcellen verminderde. Groen14 toonde aan dat insuline-achtige groeifactor de adhesiecompetentie van de muisblastocyst verbeterde op basis van het embryo-Ishikawa-cellensysteem van muizen. Het model maakt niet alleen de snelle evaluatie van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk, maar vergemakkelijkt ook de studie van andere moleculen, zoals cytokinen en transcriptiefactoren, die een rol spelen bij de implantatie van embryo's15,16. Gezien de aanzienlijke implicaties van embryo-implantatie in de reproductieve biologie, is dit model veelbelovend voor het vergroten van ons begrip van de onderliggende mechanismen en voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën.
Hoewel het huidige in-vitromodel een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van embryo-implantatie, is het belangrijk om de beperkingen ervan te erkennen. Omdat het een 2D-kweeksysteem is, mist het de complexiteit van de 3D in vivo-omgeving 17, die een aanzienlijke invloed kan hebben op cel-celinteracties en signaalroutes. Hoewel het model eerste inzichten kan verschaffen in de effecten van verschillende moleculen op de hechting van embryo's, moet het daarom worden beschouwd als een screeningsinstrument in plaats van een vervanging voor in vivo studies. Toekomstige richtingen zouden de ontwikkeling van meer fysiologisch relevante 3D-kweeksystemen kunnen omvatten die de complexe micro-omgeving van het baarmoederslijmvlies18 beter samenvatten, waardoor nauwkeurigere voorspellingen van geneesmiddelreacties en moleculaire mechanismen mogelijk worden. Bovendien zou het nuttig zijn om de integratie van dit model met andere geavanceerde technologieën, zoals microfluïdica en organ-on-a-chip-systemen 19,20 te onderzoeken om de fysiologische relevantie en voorspellende mogelijkheden ervan verder te verbeteren.
Tijdens het proces van geassisteerde voortplantingstherapie heeft superovulatie tot doel de productie van eieren in de eierstokken te verbeteren, waardoor de kans op zwangerschap toeneemt. Deze procedure kan echter resulteren in een duidelijke stijging van de oestrogeenspiegels, die de normale fysiologische drempel overschrijden. Oestrogeen, een essentieel hormoon bij de vrouwelijke voortplanting, is verantwoordelijk voor het bevorderen van de proliferatie van het baarmoederslijmvlies en het creëren van een gunstige omgeving voor de implantatie van embryo's. Bovendien reguleert het de balans van andere voortplantingshormonen, waaronder progesteron. Met behulp van een in vitro-model laten onze bevindingen zien dat hoewel een toename van de oestrogeenconcentratie in eerste instantie de implantatiesnelheden van embryo's verhoogt, te hoge niveaus buiten het fysiologische bereik dit proces aanzienlijk belemmeren. Met name de suppletie van progesteron kan dit remmende effect effectief tegengaan. Deze observaties suggereren dat abnormaal hoge oestrogeenspiegels tijdens superovulatie een factor kunnen zijn die bijdraagt aan de klinisch waargenomen lagere implantatiesnelheden die verband houden met verse embryotransfers in vergelijking met ingevroren embryotransfers. Bovendien is suppletie met progesteron na transplantatie veelbelovend bij het verbeteren van de slagingspercentages van embryo-implantatie.
We hebben een eenvoudige, kosteneffectieve en betrouwbare aanpak ontwikkeld voor de detectie van embryo-implantatie. Muizenembryo's werden, bij het bereiken van het blastocyststadium door middel van in vitro kweek, samen gekweekt met Ishikawa-cellen. Deze experimentele opstelling maakt het mogelijk om de rol en functie van verschillende moleculen, zoals cytokines, medicijnen en transcriptiefactoren, in de vroege stadia van embryo-implantatie te onderzoeken. Hoewel gevestigde cellijnen zoals Ishikawa-cellen misschien niet de meest fysiologisch relevante modelsystemen bieden in combinatie met menselijke of muizenembryo's, maken hun aanpassingsvermogen en hoge doorvoermogelijkheden ze ideaal voor grootschalige screening van geneesmiddelen in een vroeg stadium. Hoewel de 2D in vitro kweekmodellen die we hebben opgesteld verdere optimalisatie vereisen, leggen ze een basis voor ideale endometriummodellering.

Embryo-implantatie, de eerste stap van een succesvolle zwangerschap, is cruciaal voor het begrijpen van de biologische basis en het aanpakken van de uitdagingen van onvruchtbaarheid. Ethische beperkingen vormen echter aanzienlijke beperkingen bij het verzamelen van menselijke klinische embryomonsters, wat onderzoek naar de ingewikkelde interacties tussen menselijke embryo's en het baarmoederslijmvlies tijdens devroege zwangerschap belemmert. Een diepgaand begrip van deze complexe mechanismen is van vitaal belang voor het bevorderen van fundamenteel biologisch onderzoek, de ontdekking van geneesmiddelen en reproductieve gezondheid.
Eerdere in vitro-modellen maakten gebruik van adhesiemodellen waarbij monolayer menselijke endometriumepitheelcellen (RL95-2)2 werden gekweekt samen met embryonale substituten, zoals BeWo-, JAr- of Jeg-3 3-choriocarcinoomcellen. Desalniettemin was de selectie van de grootte van de sferoïden, variërend van 70-100 μm, cruciaal, aangezien grotere of kleinere celaggregaten de nauwkeurigheid van het experiment in gevaar konden brengen. Opmerkelijk was dat slechts 25% van de sferoïden in elk preparaat voldeed aan de norm voor de geschikte maat4, en er waren significante verschillen in vergelijking met de fysiologische omstandigheden van blastocysten.
Bovendien bieden driedimensionale (3D) kweeksystemen voor het baarmoederslijmvlies en de blastocyst een fysiologisch relevantere omgeving5, maar ze vereisen een hoge technische expertise, langzame celgroei, hoge resource- en onderhoudskosten, moeilijkheid bij standaardisatie en lage reproduceerbaarheid6.
In dit protocol presenteren we een kosteneffectief en snel in vitro model van embryo-implantatie dat in de meeste laboratoria kan worden ontwikkeld en gebruikt. Het algemene doel van deze methode is om een betrouwbaar en reproduceerbaar platform te bieden voor het bestuderen van de interacties tussen embryo's en het baarmoederslijmvlies in een gecontroleerde omgeving. Door belangrijke gebeurtenissen van embryo-implantatie in vitro te simuleren, wil dit model de kloof tussen diermodellen en klinische omgevingen overbruggen, waardoor nauwkeuriger en gerichter onderzoek mogelijk wordt.
Vergeleken met embryonale substituten biedt het gebruik van blastocysten van muizen een fysiologisch relevantere weergave van het in vivo embryo-implantatieproces7. Bovendien bezit de Ishikawa-cellijn, afgeleid van humaan endometriumadenocarcinoom, gemengde kenmerken van glandulair epitheel en baarmoederlumenepitheel1, waardoor het enzymen, structurele eiwitten en functionele steroïdereceptoren tot expressie kan brengen die vergelijkbaar zijn met die in normaal baarmoederslijmvlies, waardoor een fysiologisch relevant substraat wordt geboden voor embryo-implantatie. De eenvoud en snelheid van het co-cultuursysteem maken high-throughput screening en drugstesten mogelijk 8,9,10. Door een robuust en reproduceerbaar platform te bieden, biedt deze methode de mogelijkheid om ons begrip van embryo-implantatie en de impact ervan op de menselijke gezondheid te vergroten.

<table><tbody><tr><td>17-&beta;-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>Krachtigste zoogdier oestrogene hormoon</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Bacteriologische Petri-schijven 35 x 10 mm met strakke deksel, kristallijne maagdelijke polystyreen, steriel</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>ESCO</td><td>class <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg" style="margin: auto;"/>BSC</td><td>Aseptische operaties, het maken van kweekschalen, het verdelen van reagentia, enz</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Embryocultuur</td></tr><tr><td>Culture plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), vloeibaar 1:1,Bevat L-glutamine en 15 mM HEPES-buffer</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, Australische oorsprong</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Type B, poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Sterisatie reagens, intraperitoneale injectie, 50 IU/mL</td></tr><tr><td>Hyaluronidase&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Reagens kwaliteit, poeder&nbsp;</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Poeder, zonder Fenol Rood, 5 x 10 mL</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamine-200 mM (100x), vloeibaar</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Medium (1x), Vloeibaar, met Fenol Rood</td></tr><tr><td>Mineral oil&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>Mineralolie is geschikt voor gebruik als dekkingslaag om verdamping en kruisbesmetting in verschillende moleculaire biologietoepassingen te beheersen</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, liquid</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10.000 eenheden penicilline (basis) en 10.000 eenheden streptomycine (basis), gebruikmakend van penicilline G (natriumzout) en streptomycinesulfaat in 0,85% zoutoplossing</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Sterisatie reagens, intraperitoneale injectie, 50 IU/mL</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Steroïdhormoon uitgescheiden door het corpus luteum tijdens de laatste helft van de menstruatiecyclus</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Natriumpyrovaat wordt vaak toegevoegd aan celcultuurmedia als koolstofbron naast glucose</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Embryo-retrieval en observatie van embryo-ontwikkeling</td></tr></tbody></table>

opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Embryo-implantatie is de eerste stap in het tot stand brengen van een succesvolle zwangerschap. Een in vitro model voor embryo-implantatie is van cruciaal belang voor fundamenteel biologisch onderzoek, de ontwikkeling van geneesmiddelen en screening. Dit artikel presenteert een eenvoudig, snel en zeer efficiënt in vitro model voor embryo-implantatie. In dit protocol introduceren we eerst de acquisitie van blastocysten bij muizen en de voorbereiding van menselijke endometriumadenocarcinoom (Ishikawa) op implantatie, gevolgd door de co-cultuurmethode voor muizenembryo's en Ishikawa-cellen. Ten slotte hebben we een studie uitgevoerd om de impact van variërende concentraties van 17-β-oestradiol (E2) en progesteron (P4) op de adhesiepercentages van embryo's te beoordelen op basis van dit model. Onze bevindingen toonden aan dat hoge concentraties E2 de hechting van het embryo aanzienlijk verminderden, terwijl de toevoeging van progesteron de hechtingssnelheid zou kunnen herstellen. Dit model biedt een eenvoudig en snel platform voor het evalueren en screenen van moleculen die betrokken zijn bij het adhesieproces, zoals cytokines, geneesmiddelen en transcriptiefactoren die de implantatie en endometriumontvankelijkheid regelen.

In het proces van geassisteerde voortplantingstechnieken is gecontroleerde ovariële hyperstimulatie (COH) een cruciale stap, die leidt tot aanzienlijk verhoogde oestrogeenspiegels bij patiënten met meer dan 10-20 keer in vergelijking met natuurlijke cycli11. Gezien deze context vroegen we of hoge oestrogeenconcentraties in het serum van invloed zijn op de implantatie van embryo's tijdens de terugplaatsing van verse embryo's. Op basis van dit embryo-implantatiemodel hebben we de effecten van verschillende concentraties vanE2 en P4 op de implantatiesnelheid van embryo's bestudeerd12. Na uithongeringsbehandeling werden Ishikawa-cellen gedurende 48 uur geïncubeerd met E2 (0, 0,1, 1, 10 en 100 nM) of een combinatie van E2 en P4 (0-0, 100-0, 100-10 en 100-100 nM). Cellen werden vervolgens overgebracht naar met gelatine beklede platen met 12 putjes en aan elk putje werden 5-15 blastocysten toegevoegd. Elke groep werd 3x gerepliceerd en de implantatiesnelheden werden na 48 uur bepaald.
De resultaten toonden aan dat bijna-fysiologische concentraties van E2 (10 nM) de implantatiesnelheid van het embryo verhoogden in vergelijking met 0 nM E2. Ultrahoge concentraties van E2 (100 nM) verminderden echter de implantatiesnelheid van het embryo aanzienlijk. De toevoeging van P4 dosisafhankelijk verlichtte de negatieve effecten van ultrahoogE2 op implantatie (figuur 6). Aan de hand van dit in vitro model illustreren we de negatieve effecten van niet-fysiologische ultrahoge oestrogeenconcentraties op de innesteling van embryo's en introduceren we de toepassing van dit model in wetenschappelijk onderzoek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> Figuur 1: Excisie van de eileider van de muis. Rek de eileider, eierstok en vetkussentjes uit met een tang en knip eerst de eileider en eierstok af met een schaar en snijd vervolgens de eileider uit de baarmoeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> Figuur 2: Zygote ophalen. De vergrotingsampulla van de eileider wordt met een tang doorboord om het cumulus-zygote-complex vrij te maken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> Figuur 3: Isolatie van naakte zygoten met hyaluronidase-vergisting. Breng het cumulus-zygote-complex met een pincet voorzichtig over in een M2-oplossing met 0,5 mg/ml hyaluronidase en laat het een paar minuten staan totdat de cumuluscellen loskomen van de zygoten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> Figuur 4: In vitro kweek van muizenembryo's. Bereid 12 microdruppels KSOM medium, elk met een inhoud van 20 μl. Bedek de microdruppels met 3-5 ml minerale olie. Breng de muizenembryo's over van M2 medium naar de bovenste helft van de KSOM-microdruppels voor een grondige wasbeurt, plaats de gewassen embryo's in de onderste helft en incubeer ze gedurende 4 dagen bij 37 °C met 5% CO2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> Figuur 5: Implantatie van het embryo. Plaats voorzichtig 5-15 verse blastocysten in elk putje van de plaat met 12 putjes met Ishikawa-cellen voor co-cultuur. Na 48 uur incubatie de plaat snel 3x verplaatsen. Niet-gehechte embryo's vertonen een zwevende of rollende beweging over het oppervlak van de Ishikawa-cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> Figuur 6: Effect van ultrahoge concentratie oestrogeen op de implantatiesnelheid van het embryo. Het sterretje geeft een statistisch significant verschil aan, P < 0,05. Afkortingen: E2 = estradiol; P4 = progesteron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft methodologieën om een eenvoudig en efficiënt in-vitromodel voor embryo-implantatie op te zetten voor het evalueren van de relevante moleculen die het embryo-implantatieproces beïnvloeden.

Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

establishment-of-an-embryo-implantation-model-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the implantation of cancer cells onto a chicken chorioallantoic membrane to generate an in ovo model. The model successfully engrafts the ovarian cancer cells to study the progression of gynecological cancer.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

Assisted reproductieve technieken (ARTs) worden voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de daaraan verbonden Risico's te verminderen. Dit manuscript beschrijft een minimaal invasieve embryotransfer procedure met een efficiënt cryopreservatie protocol dat het gebruik van konijnen als een ideaal dierlijk model van menselijke voortplanting toelaat.

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Blastocyst biopsie en vitrificatie zijn vereist voor het efficiënt uitvoeren van preimplantatie genetische testen. Een aanpak die de sequentiële opening van de zona pellucida en het ophalen van 7-8 trophectoderm cellen in dag 5-7 post-inseminatie beperkt zowel het aantal benodigde manipulaties en de blootstelling van het embryo aan suboptimale omgevingscondities.

Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.

Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Christopher CW Hughes beschrijft het nut van zijn cultuur systeem voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Hij legt het belang van de fibroblasten dat een kritische, nog niet geïdentificeerde, oplosbare factor die het mogelijk maken endotheelcellen aan schepen in de cultuur vorm die tak, de juiste vorm lumen, en ondergaan anastomose afscheiden.

Christopher Hughes: Een in vitro model voor de Studie van angiogenese (Interview)

Ontdek een in vitro embryo-implantatiemodel voor reproductieve biologie met muizenembryo's en endometriale cellijnen. Deze methode onthult hoe oestrogeen en progesteron implantatie beïnvloeden en biedt inzichten voor IVF-behandelingen.

Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Meer video's verkennen