AC-DC Electropenetrografie voor de studie van sonderend en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op mensenhanden

Onze groep gebruikt EPG om te bestuderen hoe arbovirussen en andere factoren het sonderings- en inslikkensgedrag beïnvloeden dat optreedt tijdens de bloedvoeding, aangezien veel ziekteverwekkers het vectorgedrag zullen manipuleren om de overdracht te verbeteren. Kortom, we bestuderen wat er gebeurt tijdens een muggenbeet en hoe dat gedrag de overdracht van ziekteverwekkers en ziektepathologie beïnvloedt. Historisch gezien werd EPG voornamelijk gebruikt om plantenvoedende insecten te bestuderen.

De recente ontwikkeling van AC-DC EPG-procedures voor bloedvoedende geleedpotigen stelt ons in staat om het sonderings- en innamegedrag dat optreedt tijdens bloedvoeding in ongekend detail te bestuderen zonder de noodzaak van invasieve procedures, waardoor mogelijk de ontwikkeling van nieuwe managementstrategieën mogelijk wordt. De grootste uitdaging bij het gebruik van EPG op bloedvoedende geleedpotigen is het correleren van de golfvormen met biologische activiteiten zoals speekselvloed en overdracht van ziekteverwekkers. We hebben sterke hypothesen op basis van de elektrische oorsprong van de golfvormen en de literatuur, maar we hebben nog steeds empirisch bewijs nodig.

Steek om te beginnen de punt van een glazen weidepipet door een vlam en draai de pipet lichtjes. Inspecteer de diameter en herhaal het proces om de pipet op de gewenste maat te brengen. Om een insectenzuiger te maken, bedekt u het grote uiteinde van de gemodificeerde weidepipet met een muskietengaas en steekt u deze in de siliconenslang die is aangesloten op een laboratoriumafzuiger die de verbinding met isolatietape vastzet.

Wikkel voor de opname-elektroden een schuimblok in met verse plasticfolie voor het vasthouden van de voorbereide insectenstompjes en draadmuggen. Schraap met een scheermesje de bovenste centimeter van het koperdraad tot het aan alle kanten glanzend is. Knip vervolgens gouddraad met een diameter van 0,025 millimeter in stukken van vier tot vijf centimeter lang.

Houd de draad in een zelfsluitende tang gemaskeerd met tape om te voorkomen dat de draad wordt ingedeukt, wikkel de gouddraad voorzichtig drie keer om de koperdraad van de insectenstomp, beginnend langs de schone punt van de koperdraad. Gebruik een dissectiesonde om zilverlijm aan te brengen om de gouddraad op zijn plaats te houden. Nadat u ervoor heeft gezorgd dat er geen los eindje is, plaatst u de insectenstomp in het schuim totdat de lijm is opgedroogd.

Strijk vervolgens voorzichtig over de gouden draad die aan de insectenstomp is bevestigd om deze in een lange, zachte boog te vormen en knip de draad af tot ongeveer 2,5 tot 3 centimeter lang. Werk onder een dissectiemicroscoop, houd de insectenstomp bij de koperen spijker vast met de niet-dominante hand terwijl de gouddraad de dissectiemicroscoopfase raakt en pak het uiteinde van de gouddraad vast met een fijne punttang met behulp van de dominante hand, gebruik de fijne punttang om de punt van de gouddraad over de koperdraad van de insectenstomp in de buurt van het gelijmde gebied te kruisen. Trek vervolgens voorzichtig aan de insectenstomp totdat de gouddraad een kleine gouden lus vormt rond de tang met fijne punt.

Maak de gouddraad los en verwijder voorzichtig de tang. Terwijl u de insectenstomp in de niet-dominante hand houdt, pakt u de gouden lus vast met een tang met een fijne punt. Trek aan de insectenstomp terwijl u de tang lichtjes van de stomp wegdraait totdat de lus in een hoek van 90 graden buigt ten opzichte van de hals van de draad.

Zorg ervoor dat de gouden lus volledig gesloten is voordat u de insectenstomp terugplaatst in het schuimblok. Bereid om te beginnen de insectenzuiger en de opname-elektroden voor op de bedrading van muggen. Plaats de verdoofde muggen op hun rug op het anesthesiekussen met hun buik naar de onderzoeker gericht.

Breng na het plaatsen van een laboratoriumtape een druppel van 0,5 centimeter vers gemengde zilverlijm aan op de tape. Zuig vervolgens de buik van een verdoofde mug op in de aspirator. Gebruik de zuigkracht alleen lang genoeg om de buik op zijn plaats te houden en de mug onder de ontleedkijker boven de zilverlijm te houden met behulp van de aspirator.

Nadat je een minucijner speld in de zilverlijm hebt gedoopt, breng je een dun laagje aan op het halsbeen van de mug. Dompel de gouden lus aan het uiteinde van de opname-elektrode snel in de zilverlijm. Plaats hem op de zilveren lijmvlek op het pronotum van de mug en schud de lus heen en weer om ervoor te zorgen dat hij gelijk ligt.

Plaats vervolgens de insectenstomp terug in het schuim onder een hoek zodat de bedrade mug comfortabel kan staan als hij wakker wordt. Zodra het gewenste aantal muggen is bedraad, plaatst u het schuimblok in een opbergdoos en onderhoudt u het. Bevestig om te beginnen de opname-elektroden aan de muggen op de elektropenetografie- of EPG-experimentdag.

Zodra de host op zijn plaats staat, draait u de hoofdversterker opzij. Nadat u een bedrade mug hebt verwijderd, steekt u de koperen pin van de insectenstomp in de poort op de kopversterker. Start de opname met behulp van de hardwarebeheersoftware.

Plaats de hoofdversterker boven de hand zodat de mug comfortabel kan staan en sondeseren. Schakel de kop in amplifier terwijl deze geaard is. Pas de positie van de gastheerhand indien nodig aan om te helpen bij het meten van succes.

Gebruik de hardwarebeheersoftware om observaties met tijdstempel te maken met betrekking tot gastreacties, muggengedrag, versterkingsveranderingen en andere relevante gebeurtenissen tijdens de opname. Pas de positie van de signalen op het scherm en de softwareversterking aan met behulp van de hardwarebeheersoftware om beide signalen duidelijk zichtbaar te houden. Om de hardwareversterking aan te passen, draait u de kanaal- en vermenigvuldigingsschakelaars om.

Als die aanpassing niet voldoende is, draait u de versterkingsknop voor kanaal één naar rechts of links om de versterking respectievelijk te verhogen of te verlagen om pieken of onduidelijke pieken te voorkomen. Om de offset af te stemmen, zet u de offset-schakelaar van het kanaal op de schakelkast op neg. Draai vervolgens aan de offset-knop van het kanaal totdat de pieken in de voor- en na-seinen in dezelfde richting op het computerscherm verschijnen.

Als de mug zich in het midden van een sonde bevindt, laat hem dan afmaken. Als het niet binnen 10 minuten sonde, schakel dan de kop uit ampverliezer. Laat de gastheer voorzichtig zijn hand verwijderen en verwijder vervolgens de mug met de bijgevoegde insectenstomp.

Vervang tot slot de mug in de opbergdoos. AC-DC EPG-opnames van Culex tarsalis-muggen die zich voeden met menselijke handen genereerden interpreteerbare golfvormen die geschikt waren voor classificatie in families, typen en subtypen.