Name: Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor het isoleren van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit buffy coats. Dit protocol verbetert biobank-efficiëntie en diversiteit met hoge celviabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De NSW Health Statewide Biobank erkent dankbaar de steun van NSW Health Pathology, het NSW Office for Health and Medical Research en het Sydney Local Health District. Bovendien erkennen de auteurs dankbaar Omico en andere onderzoeksstudies die worden ondersteund door de NSW Health Statewide Biobank voor het verlenen van toestemming om intern gegenereerde gegevens te publiceren en om ongebruikte exemplaren te gebruiken voor onderzoeksdoeleinden. De auteurs bedanken professor Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, University of Sydney) voor kritisch leiderschap en discussies. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Kwaliteitscontrole bloedmonsters en intern gegenereerde gegevens (zoals celgetal, levensvatbaarheid en leeftijd van het monster bij verwerking) werden verkregen uit goedgekeurde onderzoeksstudies in de NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (HREC-goedkeuring: 2019/ETH06776). Verwerkte (d.w.z. plasma-verarmde), niet-gescreende en geanonimiseerde menselijke bloedmonsters voor volwassenen werden verzameld in EDTA-buizen. Deze bloedmonsters voor kwaliteitscontrole werden minder dan 72 uur na afname verwerkt en werden gebruikt voor PBMC-isolatie-experimenten waarbij de methoden op basis van dichtheidsgradiënt en kralen werden vergeleken. Voor de scheidingsmethode voor de dichtheidsgradiënt die in de representatieve resultaten wordt gebruikt, zie de procedure in aanvullend dossier 1. De bijzonderheden van de reagentia en de apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van volbloed
<ol><li>Keer 10 ml volbloedbuisjes (gecoat met ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA], zuurcitraat-dextrose [ACD] of lithiumheparine) 10 keer voorzichtig om bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Optioneel: Als volbloed moet worden bewaard, aliquot in cryobuisjes voor opslag bij -80 °C.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen met behulp van een rotor met een zwenkbare bak bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 22 °C met de rem AAN (9 versnelling/ 9 vertraging).</li>
</ol>2. Buffy coat collectie
<ol><li>Plaats de monsters na het centrifugeren in een biologische veiligheidskast en controleer op de drie verschillende lagen (zoals weergegeven in figuur 1). OPMERKING: RBC's worden aangetroffen in de onderste donkerrode laag van de centrifugebuis. Een witte ondoorzichtige laag met witte bloedcellen en bloedplaatjes bevindt zich boven de RBC-laag, bekend als de buffy coat. De bovenste gele laag bevat plasma.</li>
	<li>Optioneel: Als plasma moet worden opgeslagen, aliquot het plasma in cryobuizen voor opslag bij -80 °C.</li>
	<li>Pipetteer 1 ml buffy coat (uitgangsmateriaal) uit een bloedbuisje van 10 ml en breng het over naar het buisje dat is gespecificeerd en geëtiketteerd in stap 3.1 en stap 4.1 voor respectievelijk de handmatige en geautomatiseerde methoden. Draai de buffy coat (witte ondoorzichtige laag) rond met behulp van de pipetpunt en verzamel de buffy coat door te aspireren. OPMERKING: Minder dan 100 μL plasma en RBC's zijn acceptabel tijdens aspiratie. Als er meerdere bloedbuisjes worden verzameld voor één deelnemer, kunnen buffy coats worden samengevoegd; Dit kan echter van invloed zijn op de bloedplaatjesconcentratie13.</li>
	<li>Ga voor handmatige verwerking verder met sectie 3. Voor geautomatiseerde verwerking gaat u verder met hoofdstuk 4.</li>
	<li>Optioneel: Als RBC's moeten worden opgeslagen, aliquot RBC's in cryobuizen voor opslag bij -80 °C.</li>
</ol>3. PBMC zuivering - Handmatige methode
OPMERKING: Tot 8 monsters per magneethouder kunnen door één enkele operator worden verwerkt.
<ol><li>Etiket 3 x 5 ml polystyreen buisjes met de letters A-C. OPMERKING: Gebruik sequentiële nummering als u meer dan één monster uitvoert, d.w.z. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Voeg 60 μl 0,1 M EDTA (voor een uiteindelijke EDTA-concentratie van 6 mM, pH 8,0, zie aanvullend bestand 2 voor het recept) toe aan buisje A met de buffy coat die in stap 2.3 is overgebracht.</li>
	<li>Voeg 50 μL van de cocktailmixbuis (zie Materiaaltabel) toe aan buis A, meng door minstens 3 keer op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 890 μL PBS toe aan buis A en meng door minstens 3 keer op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Draai de magnetische kralenbuis (zie Tabel met materialen) gedurende 30 s.</li>
	<li>Voeg 50 μL van de magnetische kralen toe aan buis A en meng door minimaal 3 keer op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Plaats buis A onmiddellijk in de magneetstandaard en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie voorzichtig in buisje B en verzamel de heldere fractie met geen/minimale (<100 μL) RBC's voor optimaal PBMC-herstel. OPMERKING: Verstoor de kralen die aan de magneet zijn gebonden niet. Een transferpipet wordt aanbevolen.</li>
	<li>Verwijder buis A van de magneetstandaard en gooi deze weg.</li>
	<li>Voeg 50 μL magnetische kralen toe aan de celsuspensie in buis B en meng door minstens 3 keer op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Plaats buis B onmiddellijk in de magneetstandaard en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie voorzichtig in buisje C en verzamel alleen de heldere fractie. OPMERKING: Verstoor de kralen die aan de magneet zijn gebonden niet. Een transferpipet wordt aanbevolen.</li>
	<li>Verwijder buis B van de magneetstandaard en gooi deze weg.</li>
	<li>Plaats buis C onmiddellijk in de magneetstandaard en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie voorzichtig in een gelabelde centrifugebuis en vul aan tot 2 ml met PBS.</li>
	<li>Breng 50 μL van de celsuspensie over in een monsterbeker van de geautomatiseerde celteller. Voeg voor een verdunningscelgetal van 1:10 450 μl PBS toe. Ga verder met sectie 5 voor de stappen voor het tellen van cellen.</li>
</ol>4. PBMC-zuivering - Geautomatiseerde methode
OPMERKING: Er kunnen maximaal 4 monsters worden verwerkt door een enkel geautomatiseerd PBMC-instrument. Meerdere instrumenten kunnen parallel worden gebruikt door een enkele operator.
<ol><li>Label 2 x 14 ml buisjes met de letters A en B, 1 x 50 ml centrifugebuisje met letter C en 1 x 50 ml centrifugebuisje met "afval". NOTITIE: Er is slechts één afvalcontainer nodig voor elke run op het geautomatiseerde PBMC-instrument. Gebruik sequentiële nummering als u meer dan één monster uitvoert, d.w.z. 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Voeg 60 μl 0,1 M EDTA (voor een uiteindelijke EDTA-concentratie van 6 mM) toe aan buisje A met de buffy coat die in stap 2.3 is overgebracht.</li>
	<li>Draai de magnetische kralenbuis (zie Tabel met materialen)  gedurende 30 s.</li>
	<li>Schakel het geautomatiseerde PBMC-instrument in door de stroom aan de voorkant van het instrument in te schakelen.</li>
	<li>Selecteer op het startscherm van het geautomatiseerde PBMC-instrument profiel en selecteer het gewenste protocol. OPMERKING: EasySep Direct Human PBMC isolatie 19654 - buffy coat was het protocolprofiel dat voor deze PBMC-isolatie werd geselecteerd. Zie de standaardprocedure van de fabrikant voor dit profiel in protocolrapport14.</li>
	<li>Voer het startvolume in (de hoeveelheid buffy coat die in tube A wordt opgezogen) en herhaal dit voor elk monster.</li>
	<li>Selecteer alle kwadranten die dezelfde reagenskit zullen gebruiken. OPMERKING: Als hetzelfde protocol voor meer dan één kwadrant wordt gebruikt, zal het geautomatiseerde PBMC-instrument voorstellen om dezelfde reagenskit te gebruiken voor alle kwadranten14.</li>
	<li>Laad de carrousel van het instrument met gelabelde verbruiksartikelen, filtertips en buffercontainer. De reagenskit met de magnetische kralenbuis en de cocktailmixbuis moet in kwadrant 1 worden geladen. OPMERKING: Het instrument zal de gebruiker vragen of hij 1 reagensset voor alle kwadranten wil gebruiken. Selecteer 'ja' en markeer alle kwadranten met behulp van de reagenskit.</li>
	<li>Zodra het laden is voltooid, verwijdert u de deksels van verbruiksartikelen en reagentia en selecteert u uitvoeren op het instrumentenscherm.</li>
	<li>Wanneer de run is voltooid, selecteert u ontladen en verwijdert u samples (met PBMC-suspensie gelabeld in buis C) uit de carrousel van het instrument. Bewaar de magnetische kralenbuis, de cocktailmixbuis en de buffercontainer bij 4 °C. Gooi de tubes met het label A, B en afval (zie stap 4.1) en de filtertips weg. OPMERKING: Voor de geautomatiseerde methode is geen bijvullen met PBS nodig, aangezien de PBMC-suspensie een eindvolume van 7 ml produceert.</li>
	<li>Breng 500 μl van de cellen over in een monsterbeker voor een celgetal zonder verdunning. Ga verder met sectie 5 voor het tellen van cellen.</li>
</ol>5. Cellen tellen
<ol><li>Voer celtelling en levensvatbaarheid uit met behulp van de trypan-uitsluitingsmethode voor blauwe kleurstof volgens de instructies van de fabrikant15. OPMERKING: Voor de interne processen van de auteur wordt celanalyse uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde cellenteller met de volgende instellingen om de PBMC's te verkrijgen. Verdunningsfactor = 10 (voor handmatig protocol, als de celsuspensie in een laag volume is) of 1 (voor geautomatiseerd protocol) Celtype: PBMC Concentratiebereik = 5 x 104 tot 1 x 107 cellen/ml Groottebereik (diameter) = 8 μm tot 50 μm Aantal afbeeldingen = 50</li>
</ol>6. Preparaat cryopreservatie
<ol><li>Centrifugeer (met behulp van een zwenkbare emmerrotor) de monsterbuisjes bij 300 x g gedurende 8 minuten bij 22 °C met de rem AAN (9 versnelling/ 9 vertraging).</li>
	<li>Plaats de monsters na het centrifugeren terug in de biologische veiligheidskast.</li>
	<li>Verwijder met behulp van een pipet voorzichtig het supernatant. Er kan een kleine hoeveelheid supernatans bij de PBMC-pellet worden achtergelaten om ervoor te zorgen dat deze niet wordt verstoord.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 3 ml koud cryopreservatiemedium. Meng de suspensie langzaam en voorzichtig op en neer tot het homogeen is. OPMERKING: Het volume van het cyroconserveringsmedium kan worden aangepast op basis van de gewenste uiteindelijke PBMC-concentratie.</li>
	<li>Doseer 1 ml van de geresuspendeerde PBMC in een vooraf toegewezen cryobuis en plaats deze in een vriescontainer met controlesnelheid gedurende minimaal 4 uur bij -80 °C. OPMERKING: Het volume van PBMC's dat aan elke cryobuis is gekoppeld, kan worden aangepast op basis van de voorkeur van de onderzoeker.</li>
	<li>Nadat cryobuizen minimaal 4 uur bij -80 °C zijn opgeslagen, brengt u de cryobuizen over naar een tank met vloeibare stikstofdampfase voor langdurige opslag.</li>
</ol>7. Analyse van statistische gegevens
<ol><li>Representatieve resultaatgegevens werden geanalyseerd met behulp van statistische en grafische software zoals gespecificeerd in aanvullend bestand 3.</li>
</ol>

High-throughput PBMC-isolatie met behulp van immunomagnetische kralen

<ol><li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+A+review+of+recent+proteomic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).</li>
<li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li>
<li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li>
<li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).</li>
<li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371(2019).</li>
<li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vol.+27156%5BTitle%5D)+AND+%22STEMCELL+TECHNOLOGIES%22%5BJournal%5D)">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li>
<li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).</li>
<li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045(2017).</li>
<li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates%3A+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li>
<li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022).</li>
<li>Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
<li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology%2C+white+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+Publishing%22%5BJournal%5D)">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li>
<li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+buffy+coat+extract+on%3A+Methodology%2C+feasibility%2C+optimization%2C+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield%2C+but+severly+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514(2023).</li>
<li>Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+processing+of+blood+increases+the+frequency+of+activated+CD11b%2B+CD15%2B+granulocytes+which+inhibit+t-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function.</a> J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+t-cell+responses%3A+Position+statement+of+the+t-cell+workshop+committee+of+the+immunology+of+diabetes+society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society.</a> Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).</li>
<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Menselijke PBMC's zijn veelzijdige celtypen die worden gebruikt voor tal van tests; De doorvoer van isolatie is echter vaak een beperking in veel laboratoria, waaronder biobanken16. Voorheen isoleerde de NSW Health Statewide Biobank PBMC's met behulp van de dichtheidsgradiëntmethode. Automatisering werd onderzocht voor de dichtheidsgradiëntscheidingsmethode om de verwerkingscapaciteit te vergroten, maar er werden belemmeringen voor de implementatie geïdentificeerd, waaronder (i) de kosten van een vloeistofverwerker met een centrifugatie-eenheid die volledig geautomatiseerd moet zijn, met de extra vereiste voor een HEPA-eenheid om een steriel product te produceren, (ii) opgeleid personeel voor programmering, en (iii) tijd die nodig is voor protocoltesten. Daarom werden in deze studie alternatieve methoden onderzocht en werd de commercieel verkregen humane PBMC-kit geïdentificeerd die kan worden gebruikt voor handmatige en geautomatiseerde verwerking. Steriliteit is gegarandeerd omdat de apparatuur die nodig is voor de verwerking past in een standaard (lengte van 1,2 m) biologische veiligheidskast. Dit document beschrijft de wijzigingen die zijn aangebracht in het door de fabrikant aanbevolen protocol14 om de efficiëntie te verhogen en de reagenskosten te verlagen zonder dat dit ten koste gaat van de kwaliteit. Bovendien werd het protocol van de fabrikant uitgebreid met gedetailleerde stappen voor biobankmonsters voor toekomstig onderzoek, waaronder volbloed (stap 1.2), plasma (stap 2.2) en RBC (stap 2.5) aliquotering van de originele bloedbuis, evenals celtelling en cryopreservatie.
In deze studie werden drie PBMC-isolatieprotocollen vergeleken: dichtheidsgradiëntscheiding, handmatige en geautomatiseerde isolatie op basis van kralen. Er werden wijzigingen aangebracht in het handmatige protocol van de fabrikant op basis van kralen, waaronder het verwijderen van de verdunning van de buffycoat voorafgaand aan PBMC-isolatie en het elimineren van de vereiste voor afbreken voor centrifugaties, waardoor onderzoekers een aanpasbaar, kosteneffectief en high-throughput PBMC-isolatieprotocol kunnen volgen. Eerst werden acht gematchte volbloedmonsters gebruikt om PBMC's te isoleren om de scheiding van de dichtheidsgradiënt en de handmatige op kralen gebaseerde techniek te vergelijken. Belangrijk is dat de verdeling van de celpopulatie, de levensvatbaarheid van de cellen en het herstel van PBMC's niet significant verschilden tussen de twee vergeleken methoden, zoals weergegeven in respectievelijk figuur 2A-F, figuur 3A en aanvullende figuur 1. In de representatieve gegevens waren het aantal cellen hoger voor de dichtheidsgradiëntscheidingsmethode met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode, maar niet wanneer een hematologiecelanalysator werd gebruikt. De PBMC-celtype-instellingen op de celteller gebruikten een celdiameterbereik van 8-50 μm, en daarom zullen tellingen zowel PBMC's als granulocyten (ongeveer 12-15 μm in diameter) omvatten bij gebruik van de trypanblauwe uitsluitingsmethode17. Hoewel de hematologische celteller een hogere specificiteit bood dan de trypanblauwe uitsluitingsmethode, waren sommige herstelberekeningen hoger dan 100%, wat de foutmarge van het instrument weerspiegelt (zie aanvullende figuur 1). Het wordt daarom aanbevolen dat onderzoekers een combinatie van technieken voor het tellen van cellen toepassen bij het vergelijken van de opbrengsten van PBMC-isolatieprotocollen, aangezien de meeste technieken niet zowel specifieke als zeer gevoelige differentiële celtellingen bieden. Verder werden er geen tests uitgevoerd om de functionele activiteit van PBMC's van beide technieken te vergelijken, wat een beperking is van onze analyse.
Vervolgens werden de handmatige en geautomatiseerde op kralen gebaseerde methoden vergeleken en werden er geen significante verschillen tussen PBMC-opbrengst of levensvatbaarheid geïdentificeerd uit 8 gematchte monsters (Figuur 4A,B). Celpopulaties werden niet individueel vergeleken, omdat voor beide methoden dezelfde antilichaamisolatiecocktail werd gebruikt. Belangrijk is dat de hands-on tijd om 8 monsters te verwerken werd teruggebracht van 43 minuten naar 22 minuten met behulp van het geautomatiseerde protocol (Figuur 4C). Hoewel de doorvoer, het voorkomen van burn-out door technici en de consistentie van de monsterverwerking worden gegarandeerd met behulp van automatisering, zijn de kosten van reagentia en verbruiksartikelen aanzienlijk hoger, namelijk 3-4 keer meer dan de handmatige methode op basis van kralen. Dit is na het aanbrengen van wijzigingen in het protocol van de fabrikant om 1 ml buffy coat te gebruiken (vanaf een volbloedvolume van 10 ml) in plaats van het aanbevolen bereik van 2-5 ml (vanaf een volbloedvolume van 10 ml en/of groter). Als het budget een beperking is, kan de keuze voor de handmatige methode de verwerkingstijd met ~25% verkorten, terwijl de kosten voor reagentia en verbruiksartikelen vergelijkbaar blijven met die van de dichtheidsscheidingsmethode. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 8 monsters per keer per technicus te verwerken om ervoor te zorgen dat de monsters voldoende worden gespreid (~30 s/monster) binnen de incubatieperioden van 5 minuten (stappen 3.7, 3.11 en 3.14).
Bij zowel de handmatige als de geautomatiseerde op kralen gebaseerde methoden is het verwijderen van de buffy coat een cruciale stap om een optimale PBMC-isolatie te garanderen. Het is belangrijk op te merken dat in dit protocol een buffy coat wordt gebruikt in plaats van volbloed, aangezien het volume van de reagentia is gebaseerd op de volumes van het uitgangsmateriaal10. Het effectief verwijderen van het volledige volume van de buffy-vacht kan technisch uitdagend zijn. Aanvankelijk werd met deze methode de buffy coat van 0,5 ml verwijderd, maar dit werd verhoogd tot 1 ml om het herstel te verbeteren. Om een adequaat en consistent herstel van de buffy coat te garanderen, is het belangrijk om dit proces in detail te beschrijven in protocoldocumentatie en training. Het wordt aanbevolen om de pipetpunt rond te draaien tijdens het opzuigen van de buffy coat, terwijl u ervoor zorgt dat u niet te veel rode bloedcellen uit de onderliggende laag opzuigt (stap 2.3). Het is belangrijk om de antilichaamcocktail die ongewenste cellen bindt (d.w.z. granulocyten en rode bloedcellen) niet te verzadigen, wat de opbrengst en zuiverheid kan beïnvloeden10. Om het aantal rode bloedcellen dat tijdens de extractie van de buffycoat wordt verzameld, tot een minimum te beperken, moet de pipetpunt zich tussen het plasma en de buffycoatlaag bevinden. Het volume van de buffy coat kan worden verhoogd vanaf 1 ml; er moet echter voor worden gezorgd zoals hierboven beschreven dat niet meer dan 10% van het verzamelde volume RBC's bevat. Als alternatief kan een geautomatiseerde vloeistofverwerker worden gebruikt om buffy coats consequent in te zamelen18. De speciale uren die nodig zijn om instrumentprotocollen voor vloeistofbehandeling te kalibreren en problemen op te lossen, vooral gezien de kosten, zijn echter mogelijk niet haalbaar voor de meeste laboratoria.
De overgang en toepassing van het op automatiseringskralen gebaseerde protocol was essentieel gezien het doel van de NSW Health Statewide Biobank om de komende 3 jaar 23,000 PBMC's te verwerken. Hier werd aangetoond dat PBMC's tot 9 dagen na afname kunnen worden geïsoleerd uit ACD-buizen met een gemiddelde levensvatbaarheid >70%. Hoewel de opbrengsten 24 uur na het verzamelen optimaal waren, is verwerking binnen dit tijdsbestek niet altijd haalbaar, omdat de monsters mogelijk moeten worden vervoerd. Er werd aangetoond dat PBMC's geïsoleerd met de handmatige of geautomatiseerde methode op basis van kralen een opbrengst kunnen hebben van >3 x 105 cellen/ml volbloed wanneer ze binnen 4 dagen na afname worden geïsoleerd en >1 x 105 cellen/ml volbloed wanneer ze binnen 10 dagen na afname worden geïsoleerd. Lage aantallen voor monsters over 5 dagen worden opgemerkt als een beperking van deze analyse. Verder werden de gegevens niet gescheiden op basis van de leeftijden, geslachten en klinische geschiedenis van de deelnemers, aangezien deze informatie niet beschikbaar werd gesteld. Hoewel een vergelijkende analyse nodig is om de effecten van vertragingen in verwerkingstijden voor beide methoden te onderzoeken, is eerder gemeld dat vertragingen in PBMC-isolatie met behulp van de dichtheidsgradiëntmethode de celkwaliteit verminderen en de RBC-besmetting aanzienlijk verhogen19,20. Bovendien neemt het granulocytenaandeel toe als de verwerking wordt uitgesteld, en daarom moeten monsters van vergelijkbare "leeftijden" worden gegroepeerd voor stroomafwaartse analyses 20,21,22. Merk op dat dit experiment werd uitgevoerd met behulp van bloed dat was gestold met zure citroendextrose (d.w.z. trinatriumcitraat, citroenzuur en dextrose); De opbrengst en/of het aandeel van de celtypen kan echter variëren als andere anticoagulantia worden gebruikt23; daarom wordt onderzoekers geadviseerd om een geschikt antistollingsmiddel te kiezen op basis van de beoogde stroomafwaartse PBMC-analyses.
Samenvattend is een protocol voor PBMC-isolatie met behulp van magnetische kralen dat kan worden aangepast aan workflows met een hoge doorvoer gedetailleerd om te voldoen aan de vereisten voor schaalvergroting zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen. Zowel de handmatige als de geautomatiseerde methoden kunnen worden geoptimaliseerd om specifieke celconcentraties te produceren door start- en resuspensievolumes te wijzigen. De NSW Health Statewide Biobank is overgestapt van het extraheren van ~60 PBMC's per maand met behulp van de traditionele dichtheidsgradiëntscheidingstechniek naar ~300 PBMC's per maand met behulp van deze automatiseringscompatibele op kralen gebaseerde methode. Het volgende doel van de auteurs is om het geautomatiseerde platform te gebruiken om tot 1200 PBMC's per maand te verwerken en PBMC's die zijn geïsoleerd door zowel magnetische kralen (handmatig en geautomatiseerd) als dichtheidsgradiënttechnieken verder te vergelijken om de implementatie van deze techniek naar andere laboratoria te begeleiden, met een bijzondere focus op biobanken.

Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) is een techniek die lymfocyten en monocyten scheidt en isoleert van andere volbloedbestanddelen. PBMC's zijn een veelzijdig celtype dat wordt gebruikt voor tal van toepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, immunotherapie, vaccinontwikkeling, identificatie van doelwitten of biomarkers en de ontwikkeling van antilichamen/kleine moleculen 1,2. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit gezonde of zieke personen en kunnen onmiddellijk worden gebruikt in stroomafwaartse processen of worden ingevroren voor toekomstig onderzoek3. In sommige gevallen is het downstream-doel bekend, terwijl in andere, zoals gebruikelijk bij biobanking, PBMC's worden geïsoleerd en opgeslagen voor toekomstige niet-gespecificeerde toepassingen4.
Dichtheidsgradiëntcentrifugatie is de traditionele techniek voor het isoleren van PBMC's 5,6,7 uit volbloed, waarbij gebruik wordt gemaakt van de differentiële scheiding van de samenstellende celtypen op basis van celdichtheid tijdens centrifugatie. Hoewel er enige variatie in deze methode kan zijn, wordt volbloed over het algemeen verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gelaagd over een dichtheidsgradiëntmedium in een gespecialiseerde of standaard centrifugebuis en vervolgens gesponnen. Het resultaat zijn vier verschillende lagen: de bovenste plasmalaag is verrijkt met bloedplaatjes, een dunne PBMC-laag bevindt zich boven het dichtheidsgradiëntmedium en ten slotte bestaat de onderste laag uit rode bloedcellen (RBC's) en granulocyten. Hoewel deze methode eerder 'de gouden standaard'8 werd genoemd, zijn er beperkingen voor opschaling, zoals een lange verwerkingstijd, centrifugecapaciteit, moeilijkheid om andere bloedproducten (d.w.z. plasma en RBC's) te aliquoteren en moeizaam te automatiseren. Hoewel automatisering mogelijk is voor deze methode9, vereist het wel een uitgebreide programmering van een vloeistofverwerker (met een centrifugatiemodule die volledig geautomatiseerd moet worden) en zou het een langdurig proces blijven.
Voortaan wordt een alternatieve workflow gepresenteerd die gebruikmaakt van immunomagnetische parelscheiding met een magneet met acht houders voor handmatige verwerking of een instrument voor volledig geautomatiseerde verwerking. Deze methode maakt gebruik van een antilichaamcocktail die aan cellen wordt toegevoegd en ongewenste celpopulaties bindt, in dit geval bloedplaatjes, granulocyten en rode bloedcellen. Deze ongewenste populaties worden vervolgens verwijderd door magnetische scheiding, waardoor monocyten- en lymfocytenpopulaties in de negatieve fractie overblijven die klaar zijn voor stroomafwaartse verwerking10. Deze negatieve selectiemethode is sneller dan positieve selectiemethoden die extra stappen vereisen om het antilichaam en het magnetische parelcomplex uit de PBMC's te verwijderen. Negatieve selectie is bovendien voordelig omdat het is beschreven als een manier om de celfunctionaliteit te behouden11,12.

```html
<table><tbody><tr><td>Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>07930</td><td></td></tr><tr><td>Class II Biological Safety Cabinet</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>51033311</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 mL FX</td><td>BioTools</td><td>BCS-407P</td><td>Dit is de gebruikte container voor controle snelvriezen.</td></tr><tr><td>Distilled Water&nbsp;</td><td>Bacto Laboratories</td><td>561832</td><td></td></tr><tr><td>DxH 500 Hematology Analyzer&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B40601</td><td>Wordt aangeduid als externe geautomatiseerde celteller.</td></tr><tr><td>EasyEightsTM EasySepTM Magnet</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>19654</td><td>Kit bevat de magnetische kralenbuis en de cocktailmixbuis</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>E6758-500G</td><td>Instructies om 0,1M EDTA-oplossing te maken vanuit EDTA-zout staan in aanvullend bestand 2.</td></tr><tr><td>LymphoprepTM Density Gradient Medium</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge ST4 Plus Centrifuge</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>THR75009903</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 pH meter electrode</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>Orion&trade; ROSS Ultra&trade; Glass Triode&trade; pH/ATC Combination Electrodes</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>8302BNURCA</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoboSepTM Buffer 1X</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>20104</td><td>Software gebruikt voor statistische analyse.</td></tr><tr><td>RoboSepTM-S</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>21000</td><td>Volledig geautomatiseerd celscheidingsapparaat.</td></tr><tr><td>RoboSep&trade; Filter Tips</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>SepMateTM-50 (IVD) tubes</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>85460</td><td>IVD - In vitro diagnostiek. Ook bekend als SepMateTM-50 buizen</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Cell Anlayzer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td></td><td>Interne geautomatiseerde celteller. Instrument verouderd en niet langer beschikbaar voor aankoop (vanaf 31 december 2022). Alternatief instrument is de ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Productnr. C19196).</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383722</td><td></td></tr></tbody></table>
```

het isoleren van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen van buffy coats via de scheiding van de hoge doorvoer immunomagnetische parel

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) zijn een heterogene populatie van monocyten en lymfocyten. Gecryopreserveerde PBMC's hebben een stabiele levensvatbaarheid bij langdurige opslag, waardoor ze een ideaal celtype zijn voor veel stroomafwaartse onderzoeksdoeleinden, waaronder flowcytometrie, immunoassays en genoomsequencing. Doorgaans worden PBMC's geïsoleerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie, maar het is een workflow met een lage doorvoer die moeilijk en kostbaar is om op te schalen. In dit artikel wordt een workflow met hoge doorvoer gepresenteerd met behulp van een PBMC-isolatiemethode op basis van magnetische kralen die snel kan worden geïmplementeerd. De totale celconcentratie, levensvatbaarheid en populatieverdeling met PBMC's verkregen met behulp van dichtheidsgradiëntisolatie werden vergeleken, en de levensvatbaarheid van de cellen en het aandeel van celtypen waren vergelijkbaar voor beide technieken. Geïsoleerde PBMC's vertoonden een levensvatbaarheid van meer dan 70% tot 9 dagen na bloedafname, hoewel de opbrengst na 5 dagen met de helft afnam in vergelijking met PBMC's die binnen 24 uur na afname werden verwerkt. Samenvattend beschrijft dit artikel een PBMC-protocol dat gebruikmaakt van een op kralen gebaseerde aanpak om zich aan te passen aan een workflow met hoge doorvoer en toont het aan dat zowel handmatige als geautomatiseerde op kralen gebaseerde methoden de verwerkingscapaciteit kunnen vergroten en flexibiliteit kunnen bieden voor verschillende budgetten.

De verhoudingen van lymfocyten, monocyten, neutrofielen, eosinofielen en basofielen pre- (d.w.z. in volbloed) en post-PBMC-isolatie werden gemeten wanneer PBMC's werden geïsoleerd met behulp van de op kralen gebaseerde of dichtheidsgradiëntscheidingsmethode. Het aandeel lymfocyten en monocyten werd significant verrijkt door beide methoden (Figuur 2A,B). Bovendien waren de verhoudingen van neutrofielen, eosinofielen en basofielen (d.w.z. granulocyten) significant afgenomen in PBMC's geïsoleerd met de op kralen gebaseerde methode (Figuur 2C-F). Er waren geen significante verschillen in de verhoudingen van lymfocyten, monocyten, neutrofielen, eosinofielen, basofielen en granulocyten tussen de dichtheidsgradiënt en op kralen gebaseerde methoden (Figuur 2). Het percentage herstel werd aanvullend berekend voor de hierboven genoemde celtypen (zie aanvullende figuur 1). De gemiddelde levensvatbaarheid van de cellen bedroeg meer dan 95% voor beide methoden en verschilde niet significant (figuur 3A). PBMC's werden ook geteld met behulp van een groottebereik (diameter) van 8 μm tot 50 μm, waarbij de dichtheidsgradiëntscheidingsmethode ongeveer twee keer hogere totale celtellingen produceerde (Figuur 3B). 
Vervolgens werd de geautomatiseerde methode op basis van kralen vergeleken met de handmatige methode. Er werden geen significante verschillen vastgesteld voor de levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 4A) of het totale aantal cellen (Figuur 4B) met behulp van de handmatige of geautomatiseerde methode. De tijd om deze 8 monsters te verwerken werd vergeleken, inclusief hands-off tijd waarvoor geen menselijke tussenkomst nodig was. De totale verwerkingstijd van 8 monsters was 43 minuten vs. 57 min voor de handleiding vs. de geautomatiseerde methode. De geautomatiseerde methode omvatte 35 minuten hands-off verwerking (Figuur 4C).
De op kralen gebaseerde workflow van PBMC-isolatie (met volbloed- en plasmaaliquotering) werd gedurende 9 maanden getest, waarbij 1410 PBMC-monsters werden geïsoleerd uit niet-gescreend menselijk bloed met behulp van het handmatige platform voor de eerste 820 deelnemers en vervolgens met behulp van de geautomatiseerde methode voor de volgende 590 deelnemers. De verwerking werd op dezelfde dag of tot 10 dagen na het verzamelen uitgevoerd volgens de acceptatiecriteria van het onderzoek, waarbij vertragingen in de verwerking grotendeels te wijten waren aan de transittijden van het monster. Met de handmatige of geautomatiseerde methode hadden PBMC's die binnen 24 uur na de verzameling werden verwerkt de hoogste levensvatbaarheid en herstel (figuur 5). De gemiddelde levensvatbaarheid van de cellen was >90% voor PBMC's die binnen 5 dagen werden verwerkt en >70% voor PBMC's die binnen 10 dagen werden verwerkt (figuur 5A). De gemiddelde PBMC-opbrengsten daalden met 50% na 5 dagen in vergelijking met monsters die binnen 24 uur werden verwerkt (Figuur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische workflow van het op kralen gebaseerde PBMC-isolatieprotocol van buffy coat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg"> Figuur 2: Verhoudingen van lymfocyten, monocyten, neutrofielen, eosinofielen, basofielen en granulocyten in volbloed pre- en post-PBMC-isolatie door middel van dichtheidsgradiënt en op kralen gebaseerde methoden. Percentage lymfocyten (A), monocyten (B), neutrofielen (C), eosinofielen (D), basofielen (E) en granulocyten (F) in gematcht volbloed pre-PBMC-isolatie (vierkanten) en in PBMC's na isolatie via de dichtheidsgradiënt (open cirkels) of op kralen gebaseerde (gesloten cirkels) methode (n = 8). ns = niet significant, en *p < 0,05 zoals bepaald door One-Way ANOVA (A en B) of Friedman's test (C- F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg"> Figuur 3: Levensvatbaarheid en totaal celgetal van PBMC geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiënt en op kralen gebaseerde methoden. (A) Gemiddelde (± SD) cellevensvatbaarheid voor monsters die zijn verwerkt met behulp van dichtheidsgradiënt (vierkanten, donkere balk) vs. Op kralen gebaseerde (cirkels, open balk) methoden voor 8 gepaarde monsters. ns = niet significant door gepaarde t-toets. (B) Totaal celgetal voor monsters verwerkt met behulp van dichtheidsgradiënt (vierkanten, donkere balk) vs. Op kralen gebaseerde (cirkels, open balk) methoden voor 8 gepaarde monsters. *P < 0,05 bepaald met behulp van een gepaarde T-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg"> Figuur 4: Vergelijking van handmatige en geautomatiseerde methoden op basis van kralen. (A) Gemiddelde (± SD) cellevensvatbaarheid voor monsters die handmatig zijn verwerkt (vierkanten, donkere balk) vs. Geautomatiseerde (cirkels, open balk) op kralen gebaseerde methoden voor 8 gepaarde monsters. ns = niet significant volgens de Mann-Whitney-test. (B) Totaal celgetal voor monsters die met handmatige (vierkanten) zijn verwerkt vs. geautomatiseerde (cirkels) op kralen gebaseerde methoden voor 8 gepaarde monsters. ns = niet significant door gepaarde t-toets. (C) Verwerkingstijd voor 8 monsters die handmatig zijn verwerkt vs. Geautomatiseerde methoden, waaronder hands-on (lichte balk) en hands-off tijdsperioden (donkere balk). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg"> Figuur 5: Levensvatbaarheid en opbrengst van PBMC geïsoleerd uit de op kralen gebaseerde methode, handmatig of met behulp van automatisering, afhankelijk van de tijd tussen monsterafname en PBMC-opslag. (A) Gemiddelde (± 95% BI) cellevensvatbaarheid voor deelnemersmonsters die handmatig zijn verwerkt (donkere balk) vs. geautomatiseerde (open bar) bead-gebaseerde methoden. Tabel met deelnemersaantallen. ns = niet significant. n.v.t. = niet van toepassing. *p < 0,05 volgens de test van Tukey's meervoudige vergelijking. (B) Totaal celgetal voor deelnemersmonsters verwerkt met behulp van handmatige (donkere balk) vs. geautomatiseerde (open bar) bead-gebaseerde methoden. Tabel met deelnemersaantallen. ns = niet significant. n.v.t. = niet van toepassing. *p < 0,05 volgens de test van Tukey's meervoudige vergelijking. Geen waarde voor geautomatiseerde dag 10 omdat het replicatiegetal lager is dan 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Figuur van differentieel celpercentageherstel met de dichtheidsgradiënt en op kralen gebaseerde methoden. Het percentage werd berekend aan de hand van absolute celgetallen vóór isolatie in volbloed en celsuspensie na isolatie met behulp van de dichtheidsgradiëntmethode (vierkanten, donkere balk) en op kralen gebaseerde methode (cirkels, open balk) (n = 8). ns = niet significant, en *p < 0,05 zoals bepaald door de ongepaarde t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Protocol voor dichtheidsgradiënt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Bereiding van 0,1 m EDTA, pH 8,0 in PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 3: Gedetailleerde procedures die zijn uitgevoerd om de representatieve gegevens te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

isolating-human-peripheral-blood-mononuclear-cells-from-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video explains a way to purify B-cells by immunomagnetic targeting and separation from peripheral blood mononuclear cells suspension. The method involve labeling unwanted cell types with specific antibodies or ligands (linked to magnetic particles) targeting specific cell surface proteins, to be depleted from the heterogenous cell suspension by magnetic separation.

Negative Immunomagnetic Selection: A Method to Purify B-cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells

In this video, we demonstrate the isolation of monocytes from whole human blood by immunomagnetic negative separation. The isolated monocytes can be used for further downstream analysis.

Isolation of Monocytes from Whole Blood by Immunomagnetic Negative Selection

In this video, we demonstrate the isolation of peripheral blood mononuclear cells, PBMCs, containing monocytes and lymphocytes from a human buffy coat by density gradient centrifugation. The isolated PBMCs can be used for further analysis.

Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells from Human Buffy Coats

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Dit protocol biedt een toegankelijke gids voor het verzamelen, bewaren en ontdooien van perifere mononucleaire bloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyses en workflows zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Plasma- en buffy-jascollecties worden ook gedemonstreerd.

Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners

Leer een geautomatiseerde methode voor het isoleren van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit buffy coats. Dit protocol verbetert biobank-efficiëntie en diversiteit met hoge celviabiliteit.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel (Video) | JoVE Journal

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Meer video's verkennen