Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie
19 juli 2024
Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.
We zijn geïnteresseerd in de evolutie, overdracht en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan antibioticaresistentie. In het bijzonder komt het werk dat in dit artikel wordt gevoed voort uit onze interesse in milieubestendigheid. Momenteel proberen we een lokale database op te bouwen om ruimtelijke temporele variatie in antimicrobiële resistentie te volgen met behulp van gegevens van een jaar.
Een combinatie van op cultuur gebaseerde technieken en genomica wordt gebruikt om antimicrobiële resistentie op te sporen en te monitoren. DNA van monsters ondergaat PCR- of shotgun-sequencing om de microbiële diversiteit te profileren en resistentiegenen te detecteren. Daarnaast worden metabarcoding en op genen gebaseerde AMR-panels gebruikt voor geavanceerde AMR-detectie.
Van gefragmenteerd DNA met een laag moleculair gewicht is bekend dat het een reservoir van AMR-genen is, maar er is weinig aandacht besteed aan het ontwikkelen van methoden die specifiek zijn voor extractie met hoge opbrengst van lineair DNA en DNA met een laag moleculair gewicht. Ons werk richt zich op het dichten van deze kloof. Ons protocol introduceert een eenvoudige voorbewerkingsstap om het aandeel DNA met een laag moleculair gewicht dat uit afvalwater wordt geëxtraheerd, te verrijken.
Als gevolg hiervan vangt dit AMR in het milieu in zijn geheel op zonder vrije DNA-fracties uit te sluiten. Dit protocol kan met wat meer werk worden ontwikkeld tot een kitvrije methode. Dit maakt op zijn beurt de weg vrij voor de ontwikkeling van kosteneffectieve technieken voor het afvangen van AMR in het milieu.
We willen verder gaan dan mutatieresistentie en de bijdrage van niet-genetische mechanismen aan antibioticaresistentie onderzoeken. We zijn specifiek geïnteresseerd in het vergelijken van de relatieve bijdragen van horizontale genoverdracht en genomische mutaties aan aanpassing aan antibiotica in verschillende omgevingen.
Overzicht
Deze studie ontwikkelt een nieuwe techniek voor het beoordelen van antimicrobiële resistentie (AMR) in het milieu door het verrijken van extracellulair DNA met een laag molecuulgewicht uit afvalwatermonsters. Het protocol maakt de detectie van genomische en horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk en biedt een kosteneffectieve methode zonder gebruik van commerciële kits voor het monitoren van AMR in het milieu.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Antimicrobiële resistentie (AMR)
- Milieumicrobiologie
- Moleculaire genetica
Achtergrond
- De evolutie en transmissie van antibioticaresistentie in milieuomstandigheden
- Huidige tekortkomingen in extractietechnieken met een hoog rendement voor DNA met een laag molecuulgewicht
- Het belang van het monitoren van AMR voor de volksgezondheid
Gebruikte methoden
- PCR en shotgun-sequencing voor het profileren van microbiële diversiteit
- Gebruik van polyethyleenglycol en natriumchloride voor DNA-extractie
- Geavanceerde AMR-detectie via metabarcoding en gengebaseerde panels
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde extractie van lineair DNA en DNA met een laag molecuulgewicht
- Succesvolle capturing van zowel genomische als vrije DNA-fracties geassocieerd met AMR
- Fundamenteel werk voor toekomstige ontwikkelingen in technieken voor de detectie van AMR in het milieu
Conclusies
- De studie biedt een efficiënte methode voor het beoordelen van omgevings-AMR
- Bevordert verder onderzoek naar zowel genetische als niet-genetische factoren die bijdragen aan antibioticaresistentie
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Uitgebreide detectie van antimicrobiële resistentie (AMR) in milieu monsters is cruciaal voor een vroege risicobeoordeling en surveillance van de volksgezondheid. Verbeterde extractie van DNA met een laag molecuulgewicht uit afvalwater maakt een completere profilering van AMR-genreservoirs mogelijk, inclusief die welke verspreid worden via horizontale genoverdracht. Deze mogelijkheid versterkt het voorspellend vertrouwen bij monitoring van AMR in het milieu en informeert portfoliobeslissingen voor surveillance- en mitigatiestrategieën.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar reservoirs van AMR-genen in het milieu mogelijk, verder reikend dan intracellulair DNA.
- Ondersteunt de functionele validatie van de mobiliteit van AMR-genen en transmissiepaden.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van risicomodellen voor het ontstaan van AMR in het milieu.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de bereiding van DNA-monsters die geschikt zijn voor metagenomische en PCR-gebaseerde AMR-panels.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door de extractie van gefragmenteerd en extracellulair DNA te standaardiseren.
- Maakt betrouwbare detectie van AMR-genfragmenten met een lage abundantie mogelijk voor downstream-analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt omgevingssurveillance van AMR af met translationele biomarker-ontdekking voor de volksgezondheid.
- Ondersteunt de continuïteit van omgevingsdetectie tot preklinische risicobeoordeling van AMR-verspreiding.
- Zorgt voor mechanistische risicoreductie door zowel genetische als horizontaal overgedragen resistentie-elementen vast te leggen.
Integratie van pijplijn & workflow
Deze extractiemethode is geïntegreerd in de pijplijn voor milieusurveillance, van monstername tot metagenomische analyse en AMR-genprofilering.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk met betrekking tot de prevalentie en mobiliteit van AMR-genen in afvalwateromgevingen.
- Screening: Standaardiseert DNA-extractie voor reproduceerbare, kwantitatieve detectie van AMR-genen.
- Analytiek: Levert DNA met een hoge opbrengst en een laag molecuulgewicht voor robuuste vergelijkende analyses tussen monsters en tijdspunten.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen de detectie van AMR in het milieu en biomarkersstrategieën voor de volksgezondheid.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Biedt een schaalbaar, kit-onafhankelijk protocol dat aanpasbaar is aan diverse milieumatrices.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in AMR-surveillance door gefragmenteerd en extracellulair DNA vast te leggen.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerd extractieprotocol met een hoog rendement dat geschikt is voor routinematige monitoring.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk voor investeringen in AMR-mitigatie en surveillance.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor monitoring van AMR in het milieu.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de extractie van omgevings-DNA en downstream moleculaire analyse.
- Toegang tot centrifugatie, spectrofotometrie en een standaard infrastructuur voor moleculaire biologie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare monsterverwerking en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan diverse typen afvalwater- en omgevingsmonsters door middel van protocoloptimalisatie.
- Beperkt door de noodzaak voor zorgvuldige behandeling van gefragmenteerd DNA om verlies tijdens de verwerking te voorkomen.
