Name: Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Leer hoe u pyroptose in vogelcellen identificeert met flowcytometrie en dubbele kleuring van chGSDME-NT en propidiumjodide. Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van pyroptotische cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Jue Liu bedanken voor zijn vriendelijke hulp. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (nr. 2022YFD1800300), de National Natural Science Foundation of China (nr. 32130105) en het Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (nr. AUTO'S-40), China.

De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van de monstercellen
<ol><li>Kweek DF-1 (onsterfelijke kippenembryo fibroblasten) cellen in platen met zes putjes (5 x 10,5 cellen per putje) met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een 5% CO2 -incubator bij 38 °C.</li>
	<li>Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, gooit u het serumbevattende celkweekmedium weg, wast u de cellen drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voegt u vervolgens 2 ml serumvrij celcultuurmedium toe aan elk putje.</li>
	<li>Voeg de IBDV-virusoplossing (met berekende MOI) toe aan elk putje en stel een nep-geïnfecteerde controle in door het volume DMEM toe te voegen dat gelijk is aan dat van de virusoplossing.</li>
	<li>Gooi na 1 uur virusadsorptie het kweekmedium weg, was de cellen drie keer met PBS, voeg 2 ml DMEM aangevuld met 2% FBS toe aan elk putje en ga door met celculturen gedurende 24 uur.</li>
	<li>24 uur na IBDV-infectie een trypsinebehandeling uitvoeren (500 μL per putje) gedurende 1 minuut en vervolgens neutraliseren door DMEM aangevuld met 10% FBS (2 ml per putje). Daarna moeten de cellen worden geoogst om eencellige suspensies voor te bereiden voor flowcytometrie.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet.</li>
	<li>Resuspendeer de celpellet in PBS en draai de buizen voorzichtig gedurende 3 s.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen zoals beschreven in stap 1.6 (400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C).</li>
	<li>Herhaal het wassen van de cellen zoals beschreven in stap 1.7 en stap 1.8.</li>
	<li>Voer celtellingen uit met behulp van een hemocytometer onder een microscoop. Resuspendeer de cellen vervolgens in een geschikt volume flowcytometriekleuringsbuffer (zodat de uiteindelijke celconcentratie 1 x 107 cellen/ml is). Draai de suspensies voorzichtig in een draaikolk.</li>
</ol>2. Celkleuring voor flowcytometrie
<ol><li>Voeg 100 μl van de eencellige suspensies uit stap 1.10 toe aan 5 ml polystyreenbuisjes met ronde bodem (12 mm × 75 mm). Bereid nep- en IBDV-geïnfecteerde cellen voor op anti-chGSDME-NT/ CT-antilichaamkleuring en gebruik normaal muizen-IgG als isotypecontrole. Bereid ondertussen blanco controle en enkelvoudig gekleurde buisjes voor met IBDV-geïnfecteerde cellen.</li>
	<li>Voeg 1 μg Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb of normale muis IgG (als isotypecontrole) toe aan respectievelijk IBDV-geïnfecteerde en mock-controlebuisjes. Draai vervolgens de buizen voorzichtig gedurende 3 s.</li>
	<li>Incubeer de gekleurde cellen bij 2-8 °C of 30 minuten in het donker op ijs. Draai de buizen elke 10 minuten voorzichtig in een wervel.</li>
	<li>Was de cellen met 1 ml flowcytometriekleuringsbuffer door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 2-8 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet.</li>
	<li>Herhaal het wassen van de cellen zoals beschreven in stap 2.4.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 100 μL flowcytometrie kleuringsbuffer.</li>
	<li>Kleuring de cellen van de IBDV-geïnfecteerde groep en de nep-geïnfecteerde groep, evenals de PI-enkelvoudig gekleurde buisjes, met 10 μg/ml PI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door het toevoegen van 400 μL flowcytometriekleuringsbuffer voor de flowcytometrietest.</li>
</ol>3. Uitvoeren van de flowcytometrietest
<ol><li>Schakel de flowcytometer in om het instrument te initialiseren en start de software.</li>
	<li>Begin met het laten lopen van de lege regelbuis, gevolgd door de enkele gekleurde buizen om de spannings- en compensatieparameters van de flowcytometer aan te passen. Gebruik FL3- en FL4-fluorescentiekanalen, die uitzenden met 635 nm, voor het detecteren van respectievelijk PI- en Alexa Fluor 647-fluoroforen.</li>
	<li>Nadat u alle parameters hebt geconfigureerd, voert u alle voorbeelden achtereenvolgens uit.</li>
</ol>4. Analyse van flowcytometriegegevens
<ol><li>Analyseer de Alexa Fluor 647-kleuring van elk monster in het FL4-kanaalhistogram.</li>
	<li>Om het aandeel dubbelpositieve cellen in elk monster te beoordelen, gebruikt u de vierkwadrantdiagram van FL3/FL4.</li>
	<li>Stel positieve drempels in op basis van isotypecontrole IgG/PI dubbelgekleurde monsters, en zorg ervoor dat het aandeel dubbelpositieve cellen onder de 1% blijft. Deze aanpak vergemakkelijkt het meten van het aandeel dubbelpositieve cellen in alle monsters.</li>
</ol>

Kwantificering van pyroptose in met infectieuze bursale ziekte virus geïnfecteerde DF-1-cellen

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een effectieve methode voor het onderzoeken van pyroptose met behulp van flowcytometrie, bereikt door dubbele kleuring van geïnfecteerde cellen met Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb en PI. Deze benadering kan ook worden toegepast op verschillende celtypen om pyroptose te onderscheiden van andere soorten celdood, zoals apoptose en necrose.
Pyroptose, een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhankelijk is van Gasdermin (GSDM) D-geïnduceerde plasmamembraanporievorming bij zoogdieren 1,2,3, wordt traditioneel beoordeeld door middel van methoden zoals LDH-afgifte 6,15, morfologische kenmerken16 en detectie van GSDM-NT/GSDM-CT-fragmenten via Western Blot- of IFA-assays17. Geen van deze methoden kwantificeert echter nauwkeurig het percentage pyroptotische cellen. Deze studie maakt gebruik van de karakteristieke plasmamembraanporiën in pyroptotische cellen gevormd door GSDM-NT-fragmenten om een op flowcytometrie gebaseerde strategie voor hun bepaling te ontwikkelen.
Wanneer cellen dubbel werden gekleurd met chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 en PI en vervolgens werden geanalyseerd via flowcytometrie in de FL3- en FL4-fluorescentiekanalen, was pyroptose tegelijkertijd waarneembaar via twee parameters: chGSDME-NT-Alexa Fluor 647-kleuring die wijst op vorming van plasmamembraanporiën door het N-terminale fragment van gespleten chGSDME, en PI-kleuring die wijst op plasmamembraanruptuur. De gegevens tonen aan dat het aandeel chGSDME-NT/PI dubbelpositieve cellen in IBDV-geïnfecteerde cellen (ongeveer 33%) significant hoger was dan in nep-geïnfecteerde controles (P < 0,001).
De experimentele methode vereist verschillende overwegingen om nauwkeurigheid en betrouwbaarheid te garanderen. Ten eerste moet elke monsterbuis die voor stroomanalyse wordt gebruikt, niet minder dan 1 x 106 cellen bevatten om de precisie van de stroomanalyse te behouden. Gezien de meerdere wasstappen in het protocol is het raadzaam om het initiële aantal cellen in elke buis bij stap 2.1 dienovereenkomstig te verhogen, bijvoorbeeld tot 2 x 106 cellen. Het is van cruciaal belang om het wassen en overbrengen van cellen met uiterste voorzichtigheid aan te pakken om onbedoelde verstoring van de celintegriteit te voorkomen. Houd er bovendien rekening mee dat de celdichtheid, de antilichaamconcentratie en de duur van de operatie allemaal van invloed kunnen zijn op de optimale parameterinstellingen. Daarom is het noodzakelijk om de parameters en instellingen van de flowcytometer aan te passen op basis van de specifieke experimentele omstandigheden. In deze studie werden de volgende parameters gebruikt: FSC AmpGain werd ingesteld op 1,40 en SSC-spanning werd ingesteld op 490 V. De gate in de FSC/SSC-plot was ingesteld om alle celpopulaties te omvatten voor daaropvolgende FL3/4-kanaals analyse. Fluorescentiespanningen werden ingesteld op 600 V voor het FL3-kanaal (PI) en 600 V voor het FL4-kanaal (Alexa Fluor 647). De compensatie werd ingesteld op 38,0% tussen de FL4- en FL3-kanalen. Het debiet werd ingesteld op 200 gebeurtenissen/s, met een gebeurtenisdrempel die was vastgesteld op 10.000.
Met behulp van de nieuwe benadering is dit begrip van de rol van GSDME-gemedieerde pyroptose in de gastheerrespons op pathogene infecties bij kippen en de onderliggende mechanismen aanzienlijk verbeterd. Door het gebruik van specifieke antilichamen waren we in staat om porievormende chGSDME-NT te onderzoeken via flowcytometrie, waardoor pyroptotische cellen van andere werden onderscheiden en de bepaling van het aandeel cellen dat pyroptose onderging, werd vergemakkelijkt. Als gevolg hiervan biedt deze methode een duidelijk voordeel ten opzichte van Western Blot- of IFA-assays bij het detecteren van pyroptotische cellen.
De beperking van dit protocol ligt echter in het gebruik van het N-terminale fragment van kip GSDME in IBDV-geïnfecteerde cellen als een experimenteel model voor het bestuderen van pyroptose. Desalniettemin markeert deze studie het eerste succesvolle gebruik van flowcytometrie voor het bepalen van pyroptose.
Samenvattend heeft de hier beschreven flowcytometriemethode voor het onderzoeken van pyroptose een groot potentieel voor het vergroten van ons begrip van de mechanismen achter pyroptose bij zowel zoogdieren als vogels. Deze methode staat als een effectief hulpmiddel dat bijdraagt aan onderzoek naar celdood in de levenswetenschappen.

Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhangt van de vorming van plasmamembraanporiën door Gasdermin (GSDM) D bij zoogdieren 1,2,3. Vanwege de genetische deficiëntie van GSDMD bij kippen 4,5, blijft het mechanisme van pyroptose bij kippen ongrijpbaar. De Gasdermin-familie omvat geconserveerde eiwitten, waaronder GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME en DFNB59 3,6. Studies hebben gemeld dat GSDME van teleostvissen en eenden wordt gesplitst door caspase-1/3/7 of caspase-3/7 om pyroptotische celdood te induceren 7,8. De rol van GSDME-gemedieerde pyroptose in de gastheerrespons op pathogene infecties bij kippen moet echter nog worden opgehelderd.
Infectieuze bursale ziekte (IBD) is een acute, zeer besmettelijke en immunosuppressieve pluimveeziekte die wordt veroorzaakt door IBDV9. IBDV, een niet-omhuld dubbelsegmentig dubbelstrengs (ds) RNA-virus, behoort tot het geslacht Avibirnavirus in de familie Birnaviridae10. Eerdere studies door anderen en ons laboratorium hebben aangetoond dat IBDV-infectie celdood induceert in gastheercellen via verschillende routes 11,12,13,14. Eerdere bevindingen hebben aangetoond dat IBDV-infectie de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) veroorzaakt, een indicator van lytische celdood 6,15, wat suggereert dat IBDV-infectie lytische celdood in gastheercellen induceert. Bovendien tonen de gegevens aan dat IBDV-geïnfecteerde cellen morfologische kenmerken van pyroptotische celdood vertonen, waaronder celzwelling met grote bellen die uit het plasmamembraan blazen en propidiumjodide (PI)-kleuring positief, wat suggereert dat IBDV-infectie pyroptose in cellen induceert.
Aangezien de vorming van membraanporiën in pyroptotische cellen door het N-terminale fragment van gespleten GSDM (GSDM-NT) een kenmerk is van pyroptose, zouden pyroptotische cellen theoretisch kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie door GSDM-NT op het celmembraan te onderzoeken met behulp van specifieke antilichamen. In pyroptotische cellen van vogels vormt het N-terminale fragment van kippengasdermin E (chGSDME-NT) membraanporiën, waardoor propidiumjodide (PI) erdoorheen kan gaan en DNA kan binden. Het aandeel pyroptotische cellen kan dus worden gedetecteerd met behulp van flowcytometrie, waardoor pyroptose wordt onderscheiden van andere vormen van celdood, zoals apoptose en necrose. De methode voor het onderzoeken van pyroptotische cellen door middel van flowcytometrie is echter niet gerapporteerd. In deze studie werden DF-1-cellen geïnfecteerd met IBDV en werd flowcytometrie uitgevoerd om pyroptotische cellen te onderzoeken met behulp van monoklonale antilichamen (McAb) tegen het chGSDME-NT-fragment (membraangebonden) en PI-kleuring. Verrassend genoeg werden pyroptotische cellen effectief gedetecteerd door flowcytometrie. Bovendien kon het aandeel pyroptotische cellen worden gekwantificeerd. Deze bevindingen bieden een krachtig en effectief middel om pyroptose te bepalen.
Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van pyroptose in IBDV-geïnfecteerde cellen door middel van flowcytometrie met behulp van anti-chGSDME-NT, McAb en PI-kleuring. Deze methode kan ook worden uitgebreid naar andere met ziekteverwekkers geïnfecteerde cellen en worden toegepast om verschillende celtypen met pyroptose te onderzoeken, waarbij ze worden onderscheiden van andere vormen van celdood.

<table><tbody><tr><td>5 mL ronde bodem polystyreen buis (12 &times; 75 mm)</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Cel Cultuur Plaat</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antilichaam labeling kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td><td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>CellQuest software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene Bevroren Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Rund Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Staining Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Qiu-jing Biochemische Reagens &amp; Instrument Company (Shanghai, China)</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx stam</td><td></td><td></td><td>IBDV Lx stam werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China</td></tr><tr><td>Omgekeerde Microscoop</td><td>Chongqing Photoelectric Instrument Company</td><td>XDS-1B</td><td></td></tr><tr><td>Normale Muis IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline (PBS)</td><td>M&amp;C&nbsp; Gene Technology</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Jodide(PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA, 0,25%</td><td>M&amp;C&nbsp; Gene Technology</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Oscillator</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk wordt aangedreven door de vorming van plasmamembraanporiën door de N-terminus die wordt gegenereerd uit de eiwitten van de familie Cleaved Gasdermin (GSDM). Onderzoek van membraan-gehechte GSDM-NT door Western Blot is de meest gebruikte methode voor het evalueren van pyroptose. Het is echter moeilijk om met deze methode cellen met pyroptose te onderscheiden van andere vormen van celdood. In deze studie werden met Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) geïnfecteerde DF-1-cellen gebruikt als model om het aandeel cellen dat pyroptose onderging te kwantificeren door middel van flowcytometrie, met behulp van specifieke antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI) kleuring. De chGSDME-NT-positieve cellen waren gemakkelijk detecteerbaar door flowcytometrie met behulp van Alexa Fluor 647-gelabelde antilichamen tegen chGSDME-NT. Bovendien was het aandeel chGSDME-NT/PI dubbelpositieve cellen in IBDV-geïnfecteerde cellen (ongeveer 33%) significant groter dan in nep-geïnfecteerde controles (P < 0,001). Deze bevindingen geven aan dat onderzoek van membraangebonden chGSDME-NT door middel van flowcytometrie een effectieve benadering is voor het bepalen van pyroptotische cellen onder cellen die celdood ondergaan.

chGSDME-NT op het membraan van DF-1-cellen met IBDV-infectie kan gemakkelijk worden gedetecteerd door flowcytometrie Een van de belangrijkste kenmerken van pyroptotische cellen is de vorming van membraanporiën door GSDM-NT-fragmenten die worden gegenereerd uit Gasdermine-splitsing. Daarom zouden pyroptotische cellen theoretisch kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie door GSDM-NT op celmembranen te onderzoeken met behulp van specifieke antilichamen. DF-1-cellen werden dus geïnfecteerd met IBDV en de pyroptotische cellen werden onderzocht door middel van flowcytometrie met behulp van Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb- en PI-kleuring. Een aanzienlijk aantal chGSDME-NT-positieve cellen werd gedetecteerd door flowcytometrie na IBDV-infectie (Figuur 1). Daarentegen vertoonden nep-geïnfecteerde controles of cellen gekleurd met isotypecontrole IgG minimale Alexa Fluor 647-positieve cellen. Deze bevindingen tonen de effectieve en specifieke detectie van membraangebonden chGSDME-NT aan door middel van flowcytometrie. Merk op dat, aangezien de C-terminale fragmenten van gespleten chGSDME (chGSDME-CT) in het cytoplasma werden vastgehouden in plaats van te worden getransloceerd naar het plasmamembraan zoals chGSDME-NT, chGSDME-CT-fragmenten nauwelijks detecteerbaar waren door flowcytometrie met behulp van membraanoppervlakte-antigeenkleuring, wat in overeenstemming was met het feit dat pyroptose werd geassocieerd met membraangebonden chGSDME-NT-fragmenten.
Pyroptose in DF-1-cellen kan worden bepaald door flowcytometrie met behulp van dubbele kleuring van cellen met fluoresceïne-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb en PI Wanneer cellen dubbel werden gekleurd met Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb en PI, gevolgd door flowcytometrie-analyse in de FL3- en FL4-fluorescentiekanalen, konden pyroptotische cellen worden bepaald door chGSDME-NT en PI-kleuring die positief was. Zoals te zien is in figuur 2A,B, werd een aanzienlijk aantal chGSDME-NT-positieve cellen met IBDV-infectie gedetecteerd door middel van flowcytometrie-assays, en het aandeel chGSDME-NT/PI dubbelpositieve cellen in IBDV-geïnfecteerde cellen (ongeveer 33%) was significant groter dan dat van nep-geïnfecteerde controles (P < 0,001), wat suggereert dat de vorming van membraanporiën door de chGSDME-NT was synchroon met de verstoring van celmembranen, waardoor deze IBDV-geïnfecteerde cellen pyroptotische celdood ondergingen. Deze gegevens tonen duidelijk aan dat IBDV-infectie chGSDME-gemedieerde pyroptose in gastheercellen induceert. Terwijl PI single-positieve cellen andere vormen van celdood kunnen vertegenwoordigen die worden veroorzaakt door IBDV-infectie. Daarom biedt onderzoek van porievormende chGSDME-NT door middel van flowcytometrie een waardevolle methode om pyroptotische cellen te onderscheiden van cellen die andere vormen van celdood ondergaan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> Figuur 1: Onderzoek van chGSDME-NT gebonden cellen door middel van flowcytometrie. DF-1-cellen waren nep-geïnfecteerd of geïnfecteerd met IBDV bij een MOI van 1. 24 uur na infectie werden cellen geoogst en gekleurd met Alexa Fluor 647-gelabeld anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb of isotypecontrole IgG, en geanalyseerd met flowcytometrie. chGSDME-NT-kleuring positief in flowcytometrietest toonde de membraangebonden chGSDME-NT-cellen met IBDV-geïnduceerde pyroptose aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> Figuur 2: Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie met behulp van dubbele kleuring met chGSDME-NT en PI. (A) Dot-plot analyse van pyroptotische cellen door middel van flowcytometrie. DF-1-cellen werden geïnfecteerd met IBDV bij een MOI van 1. 24 uur na infectie werden cellen geoogst, gekleurd met Alexa Fluor 647-gelabeld anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb en PI en geanalyseerd met flowcytometrie. (B) Het percentage pyroptotische cellen in elke groep in (A) werd uitgezet en statistisch geanalyseerd. Tweerichtings-ANOVA werd gebruikt om statistische significantie te analyseren. De gegevens vertegenwoordigden drie onafhankelijke experimenten en werden gepresenteerd als middelen ± de SD. ***P < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel beschrijft de identificatie van pyroptotische cellen met behulp van flowcytometrie na dubbele kleuring met antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI).

Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling...

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Het genereren van een orthotopic ratmodel van pleura maligne mesothelioom door implantatie van II-45 mesothelioom cellen in de pleurale holte van immuuncompetente ratten gepresenteerd. Een stroom cytometrische methode zeven immuuncelsubklassen in deze dieren analyseren vanuit een 25 gl bloedmonster wordt ook beschreven.

Orthotope implantatie en Perifere Immune Cell Monitoring in het II-45 Syngene Rat Mesothelioom Model

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Apoptose kan worden gekenmerkt door flowcytometrische analyse van vroege en late apoptotische biomarkers. De cervicale kankercellijn, SiHa, werd geanalyseerd op apoptosebiomarkers na behandeling met Actinomycine D met behulp van een benchtop flowcytometer.

Flowcytometrische analyse van apoptotische biomarkers in actinomycine D-behandelde SiHa baarmoederhalskankercellen

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Het gehalte aan lipidehydroperoxide is de meest gebruikte indicator van ferroptotische celdood. Dit artikel demonstreert de stapsgewijze flowcytometrieanalyse van het lipidehydroperoxidegehalte in cellen bij ferroptose-inductie.

Onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom

Leer hoe u pyroptose in vogelcellen identificeert met flowcytometrie en dubbele kleuring van chGSDME-NT en propidiumjodide. Deze methode maakt nauwkeurige kwantificering van pyroptotische cellen mogelijk.

Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie

Meer video's verkennen