Name: In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus bij vrij bewegende muizen. Deze methode combineert virusinjectie en GRIN-lensimplantatie in één chirurgische procedure voor nauwkeurige neurale codering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het Shanghai Pilot Program for Basic Research - Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, het Lingang Laboratory (subsidienr. LG-QS-202203-09) en de Nationale Stichting voor Natuurwetenschappen van China (32371036).

Real-time beeldvorming voor neuronactiviteit in getande gyruscellen van muizen 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Hier beschreven we een procedure voor in vivo calciumbeeldvorming in de DG van muizen. Wij zijn van mening dat dit protocol nuttig zal zijn voor onderzoekers die DG-functies in verschillende cognitieve processen willen bestuderen, met name in gevallen waarin een genetisch geïdentificeerde subpopulatie van belang is. Hier leggen we de voordelen van ons protocol uit, benadrukken we enkele belangrijke punten in de chirurgie en bespreken we de beperkingen van deze methode.
We hebben verschillende procedures voor DG-beeldvorming uit de beschikbare literatuur getest en de experimentele procedures geoptimaliseerd zoals beschreven in dit protocol. Naar onze mening hebben de volgende drie belangrijke wijzigingen het slagingspercentage van ons protocol aanzienlijk verbeterd. Eerst combineerden we alle chirurgische ingrepen in één keer, terwijl veel calciumbeeldvormingsonderzoeken voor subcorticale regio's virusinjectie en lensimplantatie in twee afzonderlijke operaties uitvoerden. Een belangrijk voordeel van onze aanpak is dat de expressie van het virus en het herstel van het hersenweefsel nu in dezelfde periode plaatsvinden, waardoor de wachttijd voor de bereiding van muizen met de helft wordt verkort, wat meestal maanden21 duurt. Bovendien vereisen afzonderlijke operaties een nauwkeurige herpositionering van de muis, aangezien lichte kantelingen met een mismatch in het bereik van 100 μm zullen leiden tot het mislukken van de procedure. Om te voorkomen dat de lens verkeerd wordt geplaatst, ontwikkelden sommige groepen een aanpak waarbij de miniscoop aan de lens werd bevestigd en probeerden ze de neuronale expressie van de sensor te bekijken tijdens de implantatieoperatie. Deze tijdelijke oplossing vereist niet-triviale engineering van het veelgebruikte stereotaxische apparaat en is complex om te gebruiken vanwege de onderdrukking van neuronactiviteiten tijdens anesthesie. Onze methode vereist geen herpositionering van de muis, waardoor de tijd en stress die gepaard gaan met de procedure aanzienlijk worden verminderd.
Het tweede belangrijke punt van onze aanpak is dat we herhaaldelijk kleine hoeveelheden van het virus injecteren in het doelgebied22. Dit leidt ertoe dat meer cellen geïnfecteerd raken. Belangrijk is dat, vergeleken met het verhogen van de virusbelasting op een enkele injectieplaats, deze aanpak superieure resultaten opleverde in die zin dat de locaties van geïnfecteerde cellen zich gelijkmatig over het gezichtsveld verspreidden. Een ander gerelateerd belangrijk punt is dat het verdunnen van de virustiter de kwaliteit van calciumbeeldvorming verbetert. In onze ervaring wordt een overmatige hoeveelheid virus geassocieerd met het verschijnen van golfachtige clusters van activiteiten, wat consistent is met een eerder rapport23. Hoewel we aanvankelijk vermoedden dat weefselaspiratie zou kunnen leiden tot voortijdige klaring van het virus op de injectieplaats en onvoldoende expressie, hebben we een dergelijk fenomeen niet waargenomen en ons protocol leverde over het algemeen een robuuste infectie van het doelgebied op. Vergeleken met transgene muizen die GCaMP tot expressie brengen, is de virusbenadering onvermijdelijk minder consistent, maar biedt het flexibeler gebruik omdat het geen ingewikkelde fokkerij vereist. Aangezien de expressie van de GCaMP echter kan overlopen in aangrenzende hersenstructuren of ongelijk verdeeld kan raken in het doelhersengebied, is zorgvuldig onderzoek van de anatomische posities van het virus en de lens uit het vaste weefsel van cruciaal belang voor de interpretatie van de resultaten. Het combineren van regio- of celtype-specifieke Cre-lijnen met Cre-afhankelijke GCaMP-expressie zou de specificiteit van afgebeelde signalen kunnen verbeteren.
Het derde belangrijke punt van ons protocol is dat we tijdens de implantatie van de lens het inbrengen en spoelen van de lens meerdere keren hebben herhaald om er zeker van te zijn dat er geen bloedresten in het implantatiegebied achterbleven. Dit is een belangrijke operatie om weefselherstel te vergemakkelijken en het slagingspercentage van de procedure te verbeteren. Hoewel het exacte mechanisme niet bekend is, speculeren we dat het inbrengen van de lens onvermijdelijk enige schade aan het weefsel zal veroorzaken, en dat de spoelstap de bloeding die met deze schade gepaard gaat, zou verhelpen. Anders kan het lang duren voordat de hersenen zijn verdwenen door de insertie-geassocieerde bloeding, wat de kans op lokale ontsteking en macrofaaginfiltratie vergroot, die beide de optische kwaliteit zouden verminderen. Bovendien ontdekten we op de coördinaten die we in dit protocol hebben opgegeven dat het plaatsen van de lens iets dichter bij de sagittale hechting meestal resulteert in een verhoogd aantal zichtbare cellen, hoewel het belangrijk is om te voorkomen dat ze in de derde ventrikel doorboren. We hebben ook een lijst met veelvoorkomende problemen verstrekt voor een betere probleemoplossing van deze stap (Tabel 1).
De muis moet worden getraind om de dummy-miniscoop te dragen voorafgaand aan gedragsexperimenten om de impact van extra gewicht op het hoofd te minimaliseren. Meestal vindt deze training ~3 dagen plaats, waarbij elke sessie 20 minuten duurt. Tijdens de gedragsexperimenten moet de fysieke conditie van de muis regelmatig worden gecontroleerd. De gedragsprestaties van de muis zullen sterk worden beïnvloed door zijn gezondheid.
Dit protocol bevat een aantal beperkingen. Ten eerste moet worden opgemerkt dat calciumbeeldvorming een surrogaat is van neurale activiteit, die kan worden beïnvloed door de expressie van de sensoren. De beeldvormingsmethoden met één foton met behulp van een miniscoop kunnen leiden tot overlappende signalen van naburige cellen, die na latere analyse moeten worden ontmengd. Daarnaast omvat ons protocol invasieve operaties. Tijdens de implantatiestap van de GRIN-lens wordt een stuk hersenweefsel verwijderd, meestal inclusief een deel van het CA1-gebied, de retrospleniale cortex en de associatieve visuele cortex. Dit is nodig vanwege de beperking van de beelddiepte die wordt geboden door de verlichting met één foton. In onze observaties merkten we geen duidelijke gedragstekorten op bij de muizen na de chirurgische ingreep, noch in hun algemene, onbeperkte gedrag, noch in het leren van de lineaire spoortaken (aanvullende figuur S1). Als alternatief kan het gebruik van geautomatiseerde chirurgische instrumenten voor het afzuigen van hersenweefsel de fouten verminderen die gepaard gaan met handmatige bediening, waardoor de precisie van de chirurgische procedure wordt verbeterd24. Bovendien leverden onze calciumbeeldvormingsgegevens over het algemeen een normale calciumdynamiek op. Het effect op complexere cognitieve functies moet verder worden gekarakteriseerd. Een alternatieve methode voor het inbrengen van lenzen zonder weefselaspiratie is eerder beschreven25. Dit wordt bereikt door een snee in het hersenweefsel te maken langs het kanaal van de beoogde insertie en de lens direct door de opening te plaatsen. Onze ervaring is dat deze aanpak leidt tot vouwen of andere vervormingen van het hersenweefsel langs het invoegkanaal, die nog steeds invasief kunnen zijn. De hoge variabiliteit van de vervorming maakt deze aanpak minder betrouwbaar dan het protocol dat we hebben beschreven. Een ander mogelijk voorbehoud van ons protocol is dat de gedragsprestaties van de muis enigszins worden beïnvloed door de coaxkabel die de miniscoop en de miniscoop Data Acquisition (DAQ) Box met elkaar verbindt. Dit komt niet alleen doordat de draden na talloze omwentelingen naar elkaar oprollen, maar ook omdat de draad tijdens de taak een afleider kan zijn voor de muis. Het gebruik van een draadloze miniscoop26 zou dit probleem effectief oplossen. 
Ondanks de bestaande beperkingen zijn we van mening dat deze methodologie zeer nuttig kan zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het gebruik van in vivo calciumbeeldvorming om neuronale activiteitspatronen in de gyrus dentatus van de hippocampus te bestuderen. Deze in vivo calciumbeeldvormingsbenadering kan bijvoorbeeld worden toegepast om plaatscellen te onderzoeken die specifiek in het gebied van de gyrus dentatus liggen. Dit zou het mogelijk maken om te onderzoeken hoe plaatscellen informatie coderen in verschillende hersengebieden10,27. Onze validatie geeft aan dat dit protocol redelijk reproduceerbaar is, met hoge slagingspercentages, en kan worden toegepast op verschillende hersengebieden.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de hippocampus een hersenstructuur is die essentieel is voor het verwerken en ophalen van herinneringen 1,2. Sinds de jaren 1950 zijn de neurale circuits van de hippocampus bij knaagdieren een focus geweest bij het bestuderen van geheugenvorming, opslag en ophalen3. De anatomische structuren in de hippocampus omvatten de subregio's van dentate gyrus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 en subiculum4. Er bestaan complexe bidirectionele verbindingen tussen deze subregio's, waarvan de DG, CA1 en CA3 een prominent trisynaptisch circuit vormen dat bestaat uit korrelcellen en piramidale cellen5. Dit circuit ontvangt zijn primaire input van de entorhinale cortex (EC) en is een klassiek model geweest voor het bestuderen van synaptische plasticiteit. Eerder in vivo onderzoek naar de functie van de hippocampus heeft zich vooral geconcentreerd op de CA1 6,7 vanwege de gemakkelijkere toegang. Hoewel CA1-neuronen een belangrijke rol spelen bij de vorming, consolidatie en ophalen van geheugen, met name in plaatscellen voor ruimtelijk geheugen, zijn andere subregio's van de hippocampus ook van vitaal belang 8,9. In het bijzonder hebben recente studies de functies van DG bij geheugenvorming benadrukt. Er is gemeld dat plaatscellen in DG stabieler zijn dan die in CA110, en hun activiteiten weerspiegelen contextspecifieke informatie11. Verder kan activiteitsafhankelijke labeling van DG-korrelcellen worden gereactiveerd om geheugengerelateerd gedrag te induceren12. Om een beter begrip te krijgen van de informatiecodering in DG, is het daarom van cruciaal belang om de activiteiten van de DG-subregio te onderzoeken terwijl het dier geheugenafhankelijke taken uitvoert.
Eerdere studies van DG-activiteiten hebben meestal gebruik gemaakt van in vivo elektrofysiologie13. Deze techniek heeft echter enkele nadelen: ten eerste kan het bij elektrische opnames moeilijk zijn om de verschillende soorten cellen die het signaal genereren direct te identificeren. De geregistreerde signalen zijn afkomstig van zowel remmende als exciterende cellen. Daarom zijn verdere gegevensverwerkingsmethoden nodig om deze twee celtypen te scheiden. Bovendien is het moeilijk om andere informatie over het celtype, zoals projectiespecifieke subgroepen of activiteitsafhankelijke labeling, te combineren met elektrische opnames. Bovendien worden de opname-elektroden vanwege de anatomische morfologie van DG vaak in een orthogonale richting geïmplanteerd, wat het aantal neuronen dat kan worden geregistreerd aanzienlijk beperkt. Het is dus moeilijk voor elektrische opnames om honderden individuele neuronen uit de DG-structuur in hetzelfde dier te monitoren14.
Een aanvullende techniek voor het registreren van neuronactiviteiten in DG is het gebruik van in vivo calciumbeeldvorming15. Calciumionen zijn van fundamenteel belang voor cellulaire signaleringsprocessen in organismen en spelen een cruciale rol in veel fysiologische functies, vooral in het zenuwstelsel van zoogdieren. Wanneer neuronen actief zijn, neemt de intracellulaire calciumconcentratie snel toe, wat de dynamische aard van neuronale activiteit en signaaloverdracht weerspiegelt. Daarom biedt het registreren van de real-time veranderingen in intracellulaire calciumspiegels in neuronen belangrijke inzichten in de neurale coderingsmechanismen.
Calciumbeeldvormingstechnologie maakt gebruik van gespecialiseerde fluorescerende kleurstoffen of genetisch gemanipuleerde calciumindicatoren (GECI's) om calciumionenconcentraties in neuronen te controleren door veranderingen in fluorescentie-intensiteit te detecteren, die vervolgens kunnen worden vastgelegd door middel van microscopische beeldvorming16. Gewoonlijk wordt de GCaMP-familie van calciumindicatorgenen, bestaande uit groen fluorescerend eiwit (GFP), calmoduline en M13-polypeptidesequenties, gebruikt. GCaMP kan groene fluorescentie uitzenden wanneer het zich bindt aan calciumionen17, waardoor de fluctuaties in groene fluorescentie kunnen worden geregistreerd via beeldvorming18. Om duidelijke beelden van het doelhersengebied te verkrijgen, wordt bovendien meestal een Gradient Index Lens (GRIN-lens) geïmplanteerd boven het interessegebied. De GRIN-lens maakt beeldvorming mogelijk van het diepe hersengebied dat niet direct vanaf het oppervlak toegankelijk is.
Deze techniek is relatief eenvoudig te combineren met andere genetische tools om verschillende celtypen te labelen. Bovendien, aangezien het beeldvormingsvlak parallel loopt aan de oriëntatie van de cellen in DG, zijn honderden neuronen toegankelijk voor beeldvorming bij elke succesvolle operatie. In dit werk presenteren we een compleet en gedetailleerd operatieprotocol voor in vivo calciumbeeldvorming in de gyrus dentatus bij muizen (Figuur 1). De procedure omvat twee grote operaties. De eerste is om het AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-virus in de DG te injecteren. De tweede operatie is het implanteren van een GRIN-lens boven de injectieplaats van het virus. Deze twee procedures worden in dezelfde zitting uitgevoerd. Na herstel van deze operaties is de volgende stap het controleren van de beeldkwaliteit met geminiaturiseerde microscopen (miniscopen). Als het beeldvormingsveld honderden actieve cellen heeft, is de volgende procedure om de basisplaat van de miniscoop met tandheelkundig cement op de schedel van de muis te bevestigen; De muis kan dan worden gebruikt voor beeldvormende experimenten. We presenteren ook een op MATLAB gebaseerde voorbewerkingspijplijn voor het stroomlijnen van de analyse van de verzamelde calciumgegevens.

<table><tbody><tr><td>200 &mu;L universele pipette tips</td><td>Transcat Pipettes</td><td>1030-260-000-9</td><td>Voor het verwijderen van het bloed en de zoutoplossing</td></tr><tr><td>25 G luer lock stompe naald (Voorgebogen doseertips)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Voor het verwijderen van de hersenweefsels</td></tr><tr><td>3D gedrukte beschermende dop</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Om de GRIN Lens te beschermen</td></tr><tr><td>75% ethanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Voor desinfectie en het schoonmaken van het GRIN lensoppervlak</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f virus</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Voor virale injectie</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 versie 22.1</td><td>Om figuren te tekenen</td></tr><tr><td>Anesthesie luchtpomp</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-30</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Camerabesturingssoftware</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Voor het opnemen van de gedragsgegevens</td></tr><tr><td>Cannula/Keramische Ferrule Houders (GRIN lens houder)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>Om de GRIN lens vast te houden</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Om de postoperatieve pijn van de muis te verminderen</td></tr><tr><td>Coax kabel</td><td>Open ephys</td><td>CW8251</td><td>Om de miniscope en de miniscope DAQ box te verbinden</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus Life Science</td><td>FV3000</td><td>Voor het observeren van de hersenslices</td></tr><tr><td>Wattenstaafje</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd</td><td>20202140438</td><td>Voor desinfectie</td></tr><tr><td>Aangepaste kopplaat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Om de muis op het draaimolentje te houden</td></tr><tr><td>Aangepaste kopplaat houder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Om de kopplaat van de muis vast te houden</td></tr><tr><td>Basismateriaal voor kunstgebit (zelfhardend)</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Voor het bevestigen van de miniscope</td></tr><tr><td>Ontharingscrème</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Voor het verwijderen van de haren van de muis</td></tr><tr><td>Desktop digitaal stereotaxisch instrument, SGL M</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68803</td><td>Voor virale injectie en GRIN lens implantatie</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Om postoperatieve ontsteking van de muis te voorkomen</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Voor het observeren van de omstandigheden tijdens operaties</td></tr><tr><td>Gasfilterbus, groot, pakket van 6</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>GRIN lens</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Voor GRIN lens implantatie</td></tr><tr><td>GRIN lens</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Voor GRIN lens implantatie</td></tr><tr><td>Inductiekamer-muis (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>V100</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Industriële camera</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Voor het verkrijgen van de gedragsgegevens</td></tr><tr><td>Jodofoor desinfectiemiddel</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Voor desinfectie</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Vloeistof monsteropnamebuis (Glas Capillairen micropipet voor Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Voor virale injectie</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Voor het analyseren van de gegevens</td></tr><tr><td>Microboor</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>78001</td><td>Voor craniotomie</td></tr><tr><td>Micropipet trekker</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Voor het trekken van de vloeistof monsteropnamebuis</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Voor virale injectie</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Voor het opnemen van de calcium beeldgegevens</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisitie (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>Om de calcium beeldgegevens te verkrijgen</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Voor in vivo calcium beeldvorming</td></tr><tr><td>Miniscope V4 basisplaat (Variant 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td><td>Voor het vasthouden van de miniscope</td></tr><tr><td>nanoject III Programmeerbare Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Voor virale injectie</td></tr><tr><td>Oftalmische zalf</td><td>Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Om de ogen vochtig te houden</td></tr><tr><td>PCR buis</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Voor het verdunnen van het virus</td></tr><tr><td>Personal Computer (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Om de calcium beeldgegevens en gedragsgegevens op te nemen</td></tr><tr><td>Loopband</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Voor het vasthouden van de muis bij het bevestigen van de basisplaat</td></tr><tr><td>Schroevendraaier (M1.6 schroeven)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>60902</td><td>Om de M1.6 schroeven los te draaien</td></tr><tr><td>Schroevendraaier (set schroeven)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>S2</td><td>Voor het losdraaien van de set schroeven</td></tr><tr><td>Set schroef</td><td>TBD</td><td>2-56 kegelpuntschroef</td><td>Om de miniscope aan zijn basisplaat te bevestigen</td></tr><tr><td>Kleine dieren anesthesie apparaat</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R500</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Steriele spuit</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Voor het spoelen van het bloed</td></tr><tr><td>Chirurgische

in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time benaderingen zijn meestal nodig in studies van leren en geheugen, en in vivo calciumbeeldvorming biedt de mogelijkheid om neuronale activiteit bij wakkere dieren tijdens gedragstaken te onderzoeken. Omdat de hippocampus nauw verbonden is met het episodisch en ruimtelijk geheugen, is het een essentieel hersengebied geworden in het onderzoek van dit veld. In recent onderzoek werden engramcellen en plaatscellen bestudeerd door de neurale activiteiten in het hippocampus CA1-gebied vast te leggen met behulp van de miniatuurmicroscoop bij muizen tijdens het uitvoeren van gedragstaken, waaronder open-veld en lineair spoor. Hoewel de gyrus dentatus een ander belangrijk gebied in de hippocampus is, is het zelden bestudeerd met in vivo beeldvorming vanwege de grotere diepte en moeilijkheid voor beeldvorming. In dit protocol presenteren we in detail een calciumbeeldvormingsproces, inclusief hoe het virus moet worden geïnjecteerd, een GRIN-lens (gradiëntindex) moet worden geïmplanteerd en een basisplaat moet worden bevestigd voor het afbeelden van de gyrus dentatus van de hippocampus. We beschrijven verder hoe de calciumbeeldvormingsgegevens kunnen worden voorbewerkt met behulp van MATLAB. Bovendien kunnen studies van andere diepe hersengebieden die beeldvorming vereisen, baat hebben bij deze methode.

Figuur 1 toont het schema van de experimentele procedure, inclusief virusinjectie, GRIN-lensimplantatie, bevestiging van de basisplaat, in vivo calciumbeeldvorming via een miniscoop en gegevensverwerking. Over het algemeen duurt de hele procedure 1 maand. Figuur 2 toont voorbeeldprocedures van virusinjectie, inclusief de positionering van het geboorde gat op de schedel en de toestand van het hersenweefsel vóór de implantatie van de GRIN-lens.
Figuur 3 toont het proces van het verwijderen van het hersenweefsel, dat cruciaal is voor het succes van deze operatie. Naarmate er meer weefsel wordt aangezogen, worden verschillende weefsellagen zichtbaar. Deze zuigstap kan worden gestopt zodra een grijze, reflecterende laag wordt waargenomen.
Figuur 4 toont de procedure van de GRIN-implantatie, inclusief het inbrengen van de GRIN-lens, het bevestigen van de hoofdplaat op de schedel en het bedekken van de GRIN-lens met een op maat gemaakte dop. De beeldvormingskwaliteit van in vivo calciumbeeldvorming hangt af van het succes van de virusinjectie en de implantatie van de GRIN-lens.
Figuur 5 toont vier soorten resultaten van in vivo calciumbeeldvorming. Figuur 5A is het mislukte resultaat; Er werden geen actieve cellen waargenomen in het beeldvormingsveld. Figuur 5B-D zijn succesvolle resultaten. Figuur 5B heeft minder dan 10 actieve cellen, maar er zijn geen duidelijke bloedvaten. Figuur 5C heeft meer dan 50 actieve cellen en zichtbare bloedvaten. In figuur 5D zijn er honderden actieve cellen in het beeldvormingsveld; Tegelijkertijd zagen we heldere bloedvaten. Hoogwaardige in vivo calciumbeeldvorming heeft doorgaans honderden geactiveerde cellen. Minder dan een dozijn geactiveerde cellen worden verondersteld suboptimaal te zijn voor beeldvormingsresultaten. Gewoonlijk correleert het aantal cellen met de diameter van de GRIN-lens en met het deel van het hersengebied. Een grotere GRIN-lensdiameter en een dichter bij de dorsale zijde van de hersenen vergroten de kans op het waarnemen van actievere cellen. Het is ook van vitaal belang op te merken dat hoe groter de diameter van de GRIN-lens, hoe meer schade deze aanricht aan de hersenen van muizen; Het kiezen van de juiste maat is dus cruciaal. Het implanteren van een GRIN-lens met een diameter van 1 mm heeft geen invloed op het vermogen van het dier om het lineaire spoorgedrag te verwerven (aanvullende figuur S1).
Gedragsgegevens en calciumbeeldvormingsgegevens worden meestal afzonderlijk verwerkt. Gedragsgegevens van muizen kunnen handmatig worden gelabeld of worden verwerkt met behulp van open-source analysesoftware. Calciumbeeldvormingsgegevens worden verwerkt met behulp van Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) en EXTRACT in MATLAB. Figuur 6 toont de geëxtraheerde individuele cellen die over het gezichtsveld zijn gelegd en toont vijf representatieve calciumsporen van een succesvolle in vivo calciumbeeldvormingsopname. Zie Aanvullende video S1 voor een representatieve video van de onbewerkte gegevens.
Verifiëren dat de GRIN-lensimplantatie en virale injectie plaatsvinden in het beoogde hersengebied is de laatste stap en is ook erg belangrijk voor de interpretatie van de gegevens. Figuur 7 is een hersenplak van muizen die de positie van GCaMP6f-expressie (het groene fluorescentiegebied) en het spoor van de GRIN-lens laat zien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Figuur 1: Diagram van de procedures voor virusinjectie en GRIN-lensimplantatie. (A) Injecteer het AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-virus in de gyrus dentatus. (B) Implanteer de GRIN-lens boven de gyrus dentatus. (C) Controleer de beeldvormingskwaliteit na de operatie. (D) Bevestig de basisplaat van de miniscoop na controle. (E) De tijdlijn en het proces van het hele protocol. Afkorting: GRIN = Gradiëntindex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Figuur 2: Representatief chirurgisch beeld tijdens virusinjectie. (A) Plaats de muis op het stereotaxische apparaat. (B) Markeer het implantatiegebied van de GRIN-lens (het zwarte gebied). (C) Craniotomie op het doelgebied. (D) Injecteer 240 nL virus in de gyrus dentatus. (E) Verwijder de micropipet na injectie. (F) Verwijder de cortex en een deel van het CA1-hersenweefsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Figuur 3: Representatief chirurgisch beeld tijdens het opzuigen van hersenweefsel. (A) Het gebied dat door de zwarte marker wordt omsloten, wordt gepolijst met behulp van een microboor, waardoor (B) gedeeltelijk blootliggend corticaal weefsel achterblijft. Het linkerdeel toont een blootgestelde cortex en het rechterdeel is bedekt met dura- en schedelweefsel. (C) Representatief beeld tijdens de aspiratie van het corticale hersenweefsel. Het weefsel blijft lichtroze. (D) Witte stof is zichtbaar binnen het gezichtsveld, zoals aangegeven door de witte pijl. (E) Verdere afzuiging onthulde een donker grijsrood, reflecterend oppervlak onder de witte stof. Het gebied (zwarte pijl) wordt verondersteld het CA1-oppervlak te zijn en de zuigkracht mag niet dieper gaan. (F) Er is geen bloeding meer zichtbaar uit het gebied na meerdere keren spoelen met zoutoplossing. In alle panelen geven de sterretjes chirurgische instrumenten aan: een stompe naald van 30 G voor zoutoplossing en een stompe naald van 25 G voor aspiratie van hersenweefsel. Schaalbalken = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Afbeelding 4: Een voorbeeldprocedure voor GRIN-lensimplantatie en bevestiging van de basisplaat. (A) Implanteer de GRIN-lens in het hersenweefsel met behulp van een GRIN-lenshouder. (B) Plak de GRIN-lens op de juiste plaats met UV-hars; het reflecterende deel vertegenwoordigt de UV-hars. (C) Bevestig de hoofdplaat op de schedel van de muis met behulp van UV-hars. (D) Bedek de GRIN-lens met een 3D-geprinte beschermkap. (E) Controleer de kwaliteit van de operatie. De miniscoop werd bevestigd door een houder. (F) Breng de basismaterialen van de prothese aan rond de basisplaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Figuur 5: Succesvolle en niet-succesvolle beeldvormingsresultaten. (A) Mislukt in vivo calciumbeeldvormingsresultaat. Er zijn geen actieve cellen in A en meerdere regio's hebben donkere bloedvlekken zoals aangegeven door de zwarte pijlen. (B-D) Succesvolle in vivo calciumbeeldvormingsresultaten. (B) Er kunnen minder dan 10 actieve cellen worden waargenomen, maar er zijn geen significante bloedvaten op het gebied van beeldvorming. (C) Er kunnen meer dan 50 actieve cellen en significante bloedvaten worden waargenomen. (D) Honderden actieve cellen en belangrijkere bloedvaten kunnen worden waargenomen. De gestippelde cirkels geven het beeldveld weer. De groene pijlen vertegenwoordigen de cellen die GCaMP6f tot expressie brengen. De rode pijlen staan voor de bloedvaten. Schaalbalken = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve in vivo calciumbeeldvormingsgegevens van een muis die op het lineaire spoor loopt. (A) De opname van het beeldveld door de miniscoop, totaal celnummer = 227. (B) Representatieve calciumsporen. De locaties van de cel worden in A in dezelfde kleur weergegeven. (C) Gedragstaak: Lineair parcours met waterbeloningen aan beide uiteinden. (D) Representatief resultaat van de gedragsanalyse van de activiteit van de muis; Totale tijd = 100 s. Blauwe verticale lijnen geven tijdstippen van het likgedrag aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Figuur 7: Hersenweefselcoupes van muizen na een operatie. (A,B) Twee voorbeelden van hersenweefsel van muizen. De gestippelde rechthoekige gebieden geven het implantatiepad van de GRIN-lens aan. De gebogen lijnen stellen de gyrus dentatus in de hippocampus voor. Schaalbalken = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Probleem</td>
			<td>Mogelijke oorzaak</td>
			<td>Oplossing</td>
		</tr><tr><td>Het beeldveld wordt donker of zwart weergegeven.</td>
			<td>Er is een aanzienlijke hoeveelheid restbloed aan de onderkant van de GRIN-lens.</td>
			<td>Voorafgaand aan het implanteren van de GRIN-lens wordt de zoutoplossing gebruikt om het oppervlak van de operatieplaats continu te spoelen totdat er geen waarneembare bloeding meer is.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Er zijn duidelijk zichtbare bloedvaten aanwezig in het beeldvormingsveld, maar geen waarneembare neuronale activiteit.</td>
			<td>1. De expressie van het virus was suboptimaal of slecht.</td>
			<td>1. Het is raadzaam om het volgende te controleren:</td>
		</tr><tr><td>2. De locatie van de waargenomen virusexpressie komt niet overeen met de positie waar de GRIN-lens is geïmplanteerd (over het algemeen is de implantatiepositie van de GRIN-lens te ondiep in vergelijking met de gewenste locatie).</td>
			<td>een. Zorg ervoor dat de opslagcondities voor virussen geschikt zijn.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Controleer of de locatie van de virusinjectie correct is.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Controleer of de virusconcentratie geschikt is.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Tijdens de volgende chirurgische ingreep kan de diepte van de GRIN-lensimplantatie op de juiste manier worden vergroot en moet de exacte diepte elke keer dat het experiment wordt uitgevoerd zorgvuldig worden geregistreerd.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Het beeldvormingsveld vertoont enkele regionale patronen van neuronale activiteit, maar er is geen duidelijk zichtbare activiteit op individueel celniveau.</td>
			<td>1. Het volume van het geïnjecteerde virus was buitensporig hoog.</td>
			<td>1. Verdun het virus of verminder het volume van de virusinjectie.</td>
		</tr><tr><td>2. De locatie van de virusexpressie komt niet overeen met de positie van de GRIN-lens (meestal wordt de GRIN-lens geïmplanteerd op een ondiepere diepte dan de optimale positie voor de virusexpressie).</td>
			<td>2. Tijdens de volgende chirurgische ingreep kan de diepte van de GRIN-lensimplantatie op de juiste manier worden vergroot en moet de exacte diepte elke keer dat het experiment wordt uitgevoerd zorgvuldig worden geregistreerd.</td>
		</tr><tr><td>Er zijn bepaalde cellen in het beeldvormingsveld die te allen tijde een consistent helder fluorescentiesignaal behouden, en er is geen verandering in de intensiteit van deze fluorescentie.</td>
			<td>Het virus wordt tot overexpressie gebracht in een enkele cel.</td>
			<td>Verdun het virus of verminder het volume van de virusinjectie.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Grafiek voor probleemoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S1: Normale verwerving van de ruimtelijke geheugentaak door muizen die een operatie hebben ondergaan. De grafiek toont de kwantificering van het aantal voltooide proeven in de sessie van 20 minuten per dag. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. N = 3 muizen in de groep zonder operatie en 4 in de groep zonder operatie. Tweezijdige ANOVA werd gebruikt voor statistische vergelijking. Afkorting: ns = niet significant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende video S1: Representatieve onbewerkte gegevens van calciumbeeldvorming in DG. Deze video demonstreert de calciumactiviteit gedurende een periode van 5 minuten. De video wordt afgespeeld met 10x de oorspronkelijke snelheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Het ontwerp van de kopplaat. Dit bestand schetst de 2D-tekening van het ontwerp van de kopplaat. Bij de productie van de kopplaat wordt RVS gesneden volgens de tekening. De twee kleine gaatjes in de zijbalk moeten worden afgetapt met M1.6-schroefdraad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Het ontwerp van de 3D-geprinte beschermkap. Dit bestand geeft de gcode van de beschermkap slices die gebruikt kunnen worden met een 3D printer. In dit protocol gebruikten we polymelkzuur plastic als grondstof voor het printen. De kleine gaatjes aan de zijkant komen overeen met de posities van de getapte gaten op de kopplaat voor installatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: Het ontwerp van de miniscoophouder. Dit bestand bevat de gcode van de miniscoophouders, plakjes die met een 3D-printer kunnen worden gebruikt. Het cilindrische gat wordt gebruikt voor installatie op een stereotaxische houder met een M4-schroef. De gaten aan de zijkant zijn bedoeld om schroeven toe te voegen voor het vastdraaien, maar de houder kan zonder deze functie worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: Arduino-besturingscode en scripts voor de voorverwerking van ruwe calciumbeeldvormingsvideo's. Dit bestand bevat de scripts voor het besturen van Arduino en de code voor het voorbewerken van calciumbeeldvormingsgegevens. De Arduino-code regelt de gedragsinstelling waarin de muis leert likken voor waterbeloningen aan afwisselende uiteinden van een lineaire baan. Bij het leren van de taak zullen de muizen herhaaldelijk heen en weer rennen op de baan. De voorbewerkingscode voor calciumbeeldvorming voert conversie van bestandsindelingen, bewegingscorrectie, ruimtelijke downsampling en celsignaalextractie uit uit de gegevens die door de miniscoop worden verzameld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

De gyrus dentatus van de hippocampus vervult essentiële en verschillende functies bij het leren en het geheugen. Dit protocol beschrijft een reeks robuuste en efficiënte procedures voor in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de gyrus dentatus bij vrij bewegende muizen.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Source: Calvo-Rodríguez, et al. Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2015). This video demonstrates the use of fluorescence imaging to measure cytosolic calcium levels in short-term and long-term rat hippocampal cultures. By comparing young and aged neurons, it highlights how increased L-type voltage-gated calcium channel density and prolonged activation in aged neurons result in calcium overloading, a hallmark of neuronal aging.

In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

Source: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates in vivo calcium imaging in a mouse using a gradient refractive index, or GRIN lens, and a miniaturized microscope. The setup combines head fixation within a frictionless mobile cage system, stimulating neurons and triggering calcium ion influx. The GRIN lens captures calcium signaling in the brain, enabling...

Real-Time Microendoscopic Calcium Imaging in a Freely Moving Mouse

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Het huidige protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming voor het meten van de reacties van ensembles van lumbale-6 DRG-neuronen op somatische en viscerale stimuli. Er kunnen grondige vergelijkingen worden gemaakt tussen neuronen die reageren op verschillende stimuli. Dit protocol is waardevol voor het onderzoeken van mechanismen van viscerale pijn en somatische stimulatie, zoals acupunctuur.

In Vivo calciumbeeldvorming van de respons van neuronen in dorsale wortelganglia op somatische en viscerale stimuli

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Leer in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus bij vrij bewegende muizen. Deze methode combineert virusinjectie en GRIN-lensimplantatie in één chirurgische procedure voor nauwkeurige neurale codering.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen

Meer video's verkennen