Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen
5 juli 2024
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.
Dus mijn onderzoeksgroep, we zijn echt geïnteresseerd in enzymen die betrokken zijn bij DNA-replicatie en -reparatie. In het bijzonder bestuderen we enzymen van extremofiele micro-organismen en ook van ziekteverwekkers, omdat we willen begrijpen hoe deze enzymen die organismen milieu-uitdagingen laten overleven. We zijn zowel geïnteresseerd in de biologische functie van de enzymen als in de biotechnologische toepassingen.
We werken dus veel met DNA- en RNA-ligassen, en we hebben onlangs de rol vastgesteld van een minimaal type DNA-ligase dat naar de buitenkant van een bacteriële cel lijkt te worden getransporteerd. En we hebben vastgesteld dat dit een rol speelt bij de vorming van biofilm in de ziekteverwekker Neisseria gonorrhoeae. We hebben ook, samen met onze medewerkers van ArcticZymes, een nieuw RNA-naar-DNA-ligase gekarakteriseerd dat in staat is om DNA-adapters aan beide uiteinden van een stuk RNA te bevestigen.
Dus onze medewerkers bij ArcticZymes, die ook hebben bijgedragen aan dit protocol, karakteriseren verschillende DNA- en RNA-metaboliserende enzymen die potentiële toepassingen hebben in de moleculaire biologie. En dus gebruiken ze dit type protocol als een eerste stap om het spectrum van activiteiten van deze enzymen te begrijpen en deze te benchmarken ten opzichte van wat er al op de markt beschikbaar is. Het protocol biedt een eenvoudiger en veiliger alternatief voor het testen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen in vergelijking met het gebruik van radioactief gelabelde substraten.
De fluorescerend gelabelde DNA- of RNA-substraten maken onze aanpak efficiënter, omdat we de oligonucleotiden kunnen mixen en matchen om een verscheidenheid aan substraten te maken. Dus op dit moment zijn we echt gefocust op het begrijpen van de biologische functie van enkele nieuwe nucleasen die we hebben ontdekt in een Antarctisch milieugenoom. Deze nucleasen hebben homologen in andere extremofiele organismen, en dus proberen we te begrijpen welke rol ze spelen bij het laten overleven van deze microben.
We zijn ook erg geïnteresseerd in de activiteit van sommige van onze nieuwe enzymen op niet-natuurlijke nucleïnezuuranalogen en hun mogelijke toepassingen als onderdeel van een moleculair-biologische toolkit met niet-natuurlijke DNA- en RNA-substraten.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van enzymen die nucleïnezuren metaboliseren, met de nadruk op ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De analyse maakt gebruik van fluorescent gelabelde en ongelabelde oligonucleotiden om duplexen te creëren die RNA- en DNA-schade nabootsen, waardoor de karakterisering van het enzymgedrag wordt gefaciliteerd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleculaire biologie
- Enzymassays
Achtergrond
- Onderzoek naar enzymen die betrokken zijn bij DNA-replicatie en -herstel.
- Focus op extremofiele micro-organismen en pathogenen.
- Inzicht verkrijgen in de biologische functies en biotechnologische toepassingen van deze enzymen.
- Studie naar DNA- en RNA-ligasen en hun rol bij het overleven van bacteriën.
Doel van de studie
- Om enzymen die nucleïnezuren metaboliseren te karakteriseren.
- Om de rol van DNA-ligasen bij de vorming van biofilms te onderzoeken.
- Om nieuwe RNA-naar-DNA-ligasen te verkennen voor biotechnologische toepassingen.
Gebruikte Methoden
- Ontwikkeling van assays met behulp van fluorescentgelabelde oligonucleotiden.
- Karakterisering van enzymgedrag via duplexvorming.
- Samenwerking met ArcticZymes voor enzymkarakterisering.
- Onderzoek naar enzymtransport in bacteriële cellen.
Belangrijkste resultaten
- Vaststelling van de rol van een minimaal DNA-ligase bij biofilmvorming.
- Karakterisering van een nieuw RNA-naar-DNA-ligase.
- Inzichten in hoe extremofiele micro-organismen overleven onder uitdagende omgevingscondities.
- Potentiële biotechnologische toepassingen van de bestudeerde enzymen.
Conclusies
- De studie vergroot het begrip van enzymen die nucleïnezuren metaboliseren.
- Bevindingen kunnen leiden tot nieuwe biotechnologische toepassingen.
- Verder onderzoek is nodig om het volledige potentieel van deze enzymen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Gemodificeerde synthetische oligonucleotidesays maken een snelle, niet-radioactieve karakterisering van nucleïnezuur-metaboliserende enzymen mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie in biofarmaceutische R&D. Fluorescente labeling en substraatoptimalisatie vergemakkelijken een high-throughput, kwantitatieve beoordeling van enzymspecificiteit, cofactorvoorkeur en substraatcompatibiliteit. Deze mogelijkheden stroomlijnen de evaluatie van nieuwe ligasen, nucleasen en polymerasen, waardoor de portfolio-triage wordt versneld en de biologische onzekerheid in discovery-pipelines wordt verminderd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar enzymsubstraatspecificiteit en cofactorvereisten mogelijk voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoanalyse door enzymactiviteit op beschadigde of niet-natuurlijke nucleïnezuursubstraten te onderzoeken.
- Faciliteert benchmarking van nieuwe enzymen tegenover gevestigde standaarden voor portfoliotriage.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, modulaire substraten voor reproduceerbare enzymactiviteitsassays.
- Levert kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde read-outs die geschikt zijn voor schaalbare screeningworkflows.
- Elimineert de noodzaak voor het werken met radioactieve stoffen, wat de operationele veiligheid en toegankelijkheid in laboratoria vergroot.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt beoordeling van enzymactiviteit op ziekterelateerde of synthetische nucleïnezuuranalogen mogelijk wanneer dit wordt ondersteund door het ontwerp van het substraat.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door het bieden van robuuste, overdraagbare assay-formaten.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door middel van kwantitatieve enzymkarakterisering.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op oligonucleotiden gebaseerde assays positioneren enzymkarakterisering op het grensvlak van vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van iteratieve hypothesetoetsing en mechanistische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van enzymfunctie en substraatcompatibiliteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor comparatieve enzymevaluatie.
- Analytica: Maakt nauwkeurige meting van ligatie-, degradatie- en bindingsactiviteiten mogelijk via fluorescentiekwantificering.
- Translationeel onderzoek: Maakt aanpassing aan ziekterelateerde of synthetische substraten mogelijk voor preklinische afstemming.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een flexibel, niet-radioactief platform dat aanpasbaar is aan diverse enzymklassen en onderzoeksbehoeften.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van enzymdoelen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en veiligheid door het elimineren van radioactieve materialen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalefficiëntie in vroege R&D-fasen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van enzymdoelen en toolkits voor downstream ontwikkeling.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in oligonucleotidedesign en optimalisatie van enzymassays.
- Vereist toegang tot PAGE-imaging met fluorescentie en standaard infrastructuur voor moleculaire biologie.
- Vereist cross-team standaardisatie van substratenpreparatie en protocollen voor data-analyse.
- Maakt aanpassing aan diverse enzymklassen en substraatmodificaties mogelijk, afhankelijk van de commerciële beschikbaarheid van oligonucleotiden.
- Kan worden beperkt door de complexiteit van het substraatdesign of de compatibiliteit van het enzym met synthetische analogen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:24
Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides
3:54
Urea‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides
