Name: Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjecties bij volwassen muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) toe te dienen. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van gentherapie-experimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de medewerkers van de NINDS-dierenverzorgingsinstelling bedanken voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramuraal Onderzoek van de NIH, NINDS (Jaarverslag nummer 1ZIANS003129). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Op AAV gebaseerde therapieën via intraveneuze injectie in preklinische muismodellen

<ol><li>Tisdale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ideas+initiative%3A+Pilot+study+to+assess+the+impact+of+rare+diseases+on+patients+and+healthcare+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429(2021).</li>
<li>Condo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+monogenic+diseases%3A+Molecular+pathophysiology+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies.</a> Int J Mol Sci. 23 (12), 6525(2022).</li>
<li>Vaisitti, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+rare+and+monogenic+diseases+in+pediatric+organ+transplant+recipients+in+italy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374(2021).</li>
<li>Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+platforms+within+the+gene+therapy+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vector platforms within the gene therapy landscape.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+gene+therapy%3A+Where+do+we+stand+in+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023.</a> Viruses. 15 (3), 698(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+non-viral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Emerging non-viral vectors for gene delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 272(2023).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl 3rd, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28aav%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+systems+for+gene+therapy%3A+A+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biosaf%22%5BJournal%5D)">Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+aav+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: A review.</a> Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefits+and+limitations+of+animal+models+for+translational+research+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models of human diseases.</a> J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Anders, H. J., Vielhauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+validating+novel+targets+with+in+vivo+disease+models%3A+Guidelines+for+study+design%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design.</a> Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav9+transduction+mediated+by+systemic+delivery+of+vector+via+retro-orbital+injection+in+newborn%2C+neonatal+and+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice.</a> Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).</li>
<li>Hauff, P., Nebendahl, K. Drug administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauff%2C+P+%22Small+Animal+Imaging%3A+Basics+and+Practical%22">Small Animal Imaging: Basics and Practical</a>. Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. , Springer International Publishing. Cham. 127-152 (2017).</li>
<li>Saleem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+best+practice+for+validating+tail+vein+injections+in+rat+with+near-infrared-labeled+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents.</a> J Vis Exp. (146), (2019).</li>
<li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28icv%29+and+intravenous+%28iv%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), e2968(2011).</li>
<li>Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+tips+for+intravenous+administration+of+adeno-associated+virus+to+rats+and+evaluation+of+central+nervous+system+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction.</a> J Vis Exp. (126), e55994(2017).</li>
<li>Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contemporary+warming%2Frestraining+device+for+efficient+tail+vein+injections+in+a+murine+fungal+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model.</a> J Vis Exp. (165), e61961(2020).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+tail+vein+metastasis+assays+and+real-time+in+vivo+imaging+to+quantify+breast+cancer+metastatic+colonization+and+burden+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs.</a> J Vis Exp. (154), e60687(2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Compound+administration+I%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Compound administration I.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice. UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf">https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf</a> (2023).</li>
<li>Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf">https://animalcare.ubc.ca/sites/default/files/documents/ACS-2012-Tech03.pdf</a> (2012).</li>
<li>Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-detection+of+gfp+and+dystrophin+in+skeletal+muscle+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections.</a> Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).</li>
<li>Burr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometric-like+scaling+of+aav+gene+therapy+for+systemic+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).</li>
<li>Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+screening+methods+underreport+aav-mediated+transduction+and+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing.</a> Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).</li>
<li>Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+optimization+of+aav+vectors+for+human+gene+therapy+of+glaucoma+and+their+reversed+cell+entry+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics.</a> Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+formation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor formation assays.</a> Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen openbaarmakingen die relevant zijn voor het werk dat in dit artikel is gepubliceerd.

Op AAV gebaseerde therapieën hebben een groot potentieel voor monogene aandoeningen vanwege de veelzijdigheid van AAV als gentherapievector, waardoor het mogelijk is om AAV's aan te passen aan de verschillende toedieningsbehoeften van verschillende aandoeningen 4,5,7,9. AAV's worden vaak toegediend via IV-injectie in preklinische muismodellen om de veiligheid en werkzaamheid van potentiële therapieën te testen16. Aangezien verschillende geïnjecteerde AAV-doses kunnen leiden tot duidelijke verschillen in de experimentele resultaten, is het van cruciaal belang dat onderzoekers in staat zijn om de beoogde AAV-dosis consequent te injecteren om de validiteit en robuustheid van de gegenereerde in-vivogegevens te waarborgen28. IV-injecties worden veel gebruikt, maar ze zijn technisch uitdagend en vereisen uitgebreide training en voortdurende oefening om een vaardigheidsniveau te ontwikkelen en te behouden dat zorgt voor consistent succesvolle injecties 16,17,18,19. Naast het correct injecteren van AAV, is het meestal gewenst om assays te gebruiken om de biodistributie en afgifte-efficiëntie van de geïnjecteerde AAV aan de doelweefsels of -cellen te beoordelen29,30.
Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen om gemakkelijk IV-injecties met succes en consistent uit te voeren door de details van een geoptimaliseerd IV-injectieprotocol voor het toedienen van AAV bij 7-9 weken oude, niet-verdoofde muizen grondig te beschrijven. Het is belangrijk op te merken dat muizen die duidelijk kleiner of groter zijn dan wildtype muizen in de hier gebruikte leeftijdscategorie, een grotere uitdaging kunnen vormen vanwege een verminderde zichtbaarheid van de aderen of onverenigbaarheid met de restrainers die bij deze methode worden gebruikt. Eerder is gemeld dat staart IV-injecties niet geschikt zijn voor intraveneuze toediening van reagentia bij muizen jonger dan 6 weken oud vanwege de kleine vaatgrootte31. Hoewel het mogelijk is, kan het moeilijk zijn om muizen met een gewicht van minder dan 22,0 g consequent met succes te injecteren. Onderzoekers die muizen van atypische grootte gebruiken, moeten mogelijk aanpassingen aan de procedure maken. Dit protocol schetst ook verschillende tests die kunnen worden gebruikt om de biodistributie en transductie-efficiëntie van AAV te beoordelen.
Bij het volgen van dit protocol moeten enkele kritieke punten in gedachten worden gehouden. Tijdens de injectie zorgen naalden van 29 G voor meer weerstand als de naald zich niet in de ader bevindt. Dit vermindert het volume dat verloren gaat door onbedoelde perivasculaire injectie van de oplossing tijdens mislukte injectiepogingen. Insulinespuiten hebben kleinere dode volumes dan gewone spuiten. Als u een andere spuit en/of naald gebruikt dan de hier vermelde, moet mogelijk een extra injectievolume worden voorbereid in protocolstappen 1.1.3.3 om rekening te houden met een groter dode ruimtevolume (bijv. voeg 30 μl toe aan de beoogde dosis in plaats van 15 μl).
Als er fijne luchtbellen worden gevormd aan de zijkanten van de spuit tijdens het opzuigen van de AAV-dosis in de spuit, trek de injectie dan langzaam verder omhoog in de spuit. Hierdoor worden de meeste kleine luchtbelletjes verwijderd. Laad ten minste 10-15 μL extra AAV tot het beoogde volume dat moet worden geïnjecteerd. Dit extra volume is bedoeld om rekening te houden met eventueel volume dat verloren zou kunnen gaan tijdens het verdrijven van luchtbellen of mogelijke mislukte injectiepogingen. (bijv. als het te injecteren doelvolume 150 μl is, laadt u 165 μl in de spuit (halverwege tussen de markeringen van 160 μl en 170 μl op de schaal van de spuit). Als de naald correct in de ader is geplaatst en het volume in de spuit 165 μl bedraagt onmiddellijk voor de succesvolle injectiepoging, dient u het reagens toe te dienen totdat er nog 15 μl in de spuit zit (halverwege tussen de markeringen van 10 μl en 20 μl), waardoor 150 μl (165 μl - 150 μl = 15 μl)) wordt toegediend). Door het afschuinlumen (schuine kant naar boven) uit te lijnen met de schaal van de spuit, kan het geleverde volume tijdens de injectie worden gevolgd.
Sommige onderzoekers geven er misschien de voorkeur aan om de muis op zijn zij te leggen, zodat een van zijn aderen recht en gemakkelijk toegankelijk is in vergelijking met een muis op zijn poten. De staart van een muis op zijn kant zal echter onder verschillende hoeken schuin staan, afhankelijk van de grootte van de muis, waardoor de injectiehoek moet worden aangepast bij het injecteren van muizen van verschillende groottes. Dit kan een negatieve invloed hebben op de consistentie van het succes van de procedure. Tijdens de eerste oefenpogingen kunnen onderzoekers beide muisbeperkende oriëntaties proberen om hun voorkeursaanpak te bepalen. Door de muis op zijn poten te hebben, hebben beide laterale staartaders snel en gemakkelijk toegang. Dit verkort de fixatietijd wanneer toegang tot beide aders nodig is in het geval van meerdere mislukte injectiepogingen.
Als de laterale ader dicht bij de staartbasis (dichter bij het lichaam van de muis) wordt geïnjecteerd (vooral voor muizen met een gewicht van >30 g.), pas dan de injectiehoek aan van evenwijdig aan de ader tot 5°-10° ten opzichte van de ader, aangezien de ader aan de staartbasis iets dieper is dan distaal.
De hier vermelde RNase-digestie- en RNA-contaminatiecontroleprotocollen werden geverifieerd op DNA-monsters geïsoleerd uit vers ingevroren leverweefsels die in totaal 175-700 ng nucleïnezuren in 20 μL bevatten. Het RNase-verteringsprotocol werd ook getest op DNA-monsters geïsoleerd uit vers ingevroren leverweefsels en FACS-gesorteerde cellen om de aanwezigheid van het vectorgenoom en het muizengenoom na RNase-spijsvertering te bevestigen. De resultaten werden gevisualiseerd met behulp van agarosegelelektroforese van eindpunt PCR-amplificatie van de doelamplicons.
Het volgen van de beschreven methodologie kan de trainings- en oefentijd die nodig is om IV-injecties onder de knie te krijgen, verminderen en resulteren in een hogere succesvolle injectiesnelheid, wat reagentia zou besparen. Dit protocol maakt gebruik van eenvoudige en veelgebruikte tools zonder dat er geavanceerde apparatuur of instellingen nodig zijn die mogelijk niet direct beschikbaar zijn. Bovendien kunnen de hier vermelde IV-injectiestappen worden toegepast op een breed scala aan injectaten die intraveneus moeten worden toegediend, zoals antisense-oligonucleotiden (ASO's), met de juiste aanpassingen aan de injectiebereidingsstappen, afhankelijk van het injectaat.

Monogene aandoeningen vormen 80% van de zeldzame ziekten, die samen wereldwijd 300 miljoen mensen treffen 1,2. Er zijn momenteel geen goedgekeurde curatieve therapieën voor de meeste van deze sterk slopende zeldzame aandoeningen 1,2,3. Monogene aandoeningen zijn echter ideale kandidaten voor gentherapieën die disfunctionele genen kunnen vervangen, aanvullen, corrigeren of tot zwijgen brengen 4,5. Momenteel worden meerdere vectoren ontwikkeld en gebruikt om gentherapieën af te leveren aan specifieke celtypen 4,6. Een van die vectoren is adeno-geassocieerd virus (AAV). AAV is een niet-pathogeen parvovirus dat steeds vaker wordt gebruikt als gentherapievector7. In vergelijking met andere virale vectoren heeft AAV een lagere immunogeniciteit, een lager potentieel om te integreren in het genoom van de gastheer en het vermogen om delende en niet-delende cellen in verschillende weefsels efficiënt te transduceren 7,8. Bovendien zijn er meerdere benaderingen ontwikkeld om AAV's met gewenste kenmerken zoals specifiek weefseltropisme of verder verminderde immunogeniciteit te ontwikkelen en te identificeren, wat de veelzijdigheid van AAV als virale vector voorverschillende indicaties aanzienlijk vergroot. Deze factoren hebben AAV tot een veel onderzochte gentherapievector gemaakt en hebben geleid tot de ontwikkeling van meerdere door de FDA goedgekeurde op AAV gebaseerde gentherapieën10.
Muismodellen worden vaak gebruikt om potentiële gentherapieën in vivo te testen en de pathomechanismen van monogene aandoeningen beter te begrijpen. Dit komt door de recapitulatie van de pathologieën van verschillende aandoeningen door de muismodellen, de gelijkenis van hun genoom met het menselijk genoom en het relatieve gemak van het hanteren, onderhouden en genereren vanmuizen 11,12,13. In vivo testen is vooral belangrijk bij het bestuderen van aandoeningen die meerdere systemen of regio's van het lichaam aantasten, zoals spierdystrofieën. Voor deze aandoeningen zijn in-vitrotesten mogelijk niet voldoende om de veiligheid, werkzaamheid, farmacokinetiek en farmacodynamiek van therapieën die bedoeld zijn om verschillende lichaamsregio's te bereiken na systemische toediening uitgebreid te beoordelen14.
Er kunnen verschillende systemische toedieningsroutes worden gebruikt om medicijnen toe te dienen. Elke route heeft zijn voor- en nadelen en de mate van compatibiliteit met het onderzochte diermodel en medicijn15. Intraveneuze (IV) laterale staartaderinjectie is een veelgebruikte route voor systemische toediening van AAV bij muizen16. Laterale injecties in de staartader maken een snelle en directe toediening van het injectaat in de bloedbaan van de muis mogelijk, wat zorgt voor een hoge biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel in de systemische circulatie17. Ze vereisen ook relatief eenvoudige en algemeen beschikbare hulpmiddelen om te worden uitgevoerd. Echter, voornamelijk vanwege de kleine diameter van de staartader en de moeilijkheid om de ader te lokaliseren, zijn laterale staartaderinjecties technisch uitdagend en vereisen ze een hoge mate van vaardigheid en constante oefening om mislukte injectiepogingen of onvolledige dosisafgifte te voorkomen 16,17,18,19. Deze kunnen leiden tot het verlies van dure reagentia of onnauwkeurige resultaten, vooral als de onvolledige injectie niet wordt herkend tijdens het uitvoeren van de injectie. Onze ervaring die hier is samengevat, is gebaseerd op protocollen die zijn gerapporteerd in goed gedocumenteerde artikelen die we hebben aangepast voor ons gebruik, waarbij we verschillende stappen van de laterale staartaderinjectieprocedure hebben geoptimaliseerd om consistent succesvolle injecties te garanderen 20,21,22,23,24,25,26,27.
Hier beschrijven we dit gedetailleerde geoptimaliseerde laterale staartader-injectieprotocol om AAV toe te dienen aan niet-verdoofde muizen van 7-9 weken oud met behulp van eenvoudige en algemeen beschikbare hulpmiddelen. Daarnaast bieden we de protocollen voor methoden die worden gebruikt om AAV-afgifte en biodistributie te beoordelen. Deze protocollen hebben betrekking op weefselverzameling na injectie, weefselfixatie, DNA-extractie en kwantificering van het vectorgenoom van digitale polymerasekettingreactie (dPCR) per diploïde genoom (vg/dg). Het IV-injectieprotocol en de aanwijzingen die hier worden gegeven, zijn bedoeld om het gemak van het succesvol uitvoeren van laterale staartaderinjecties te vergroten. Dit zal mogelijk helpen de tijd die nodig is om de injectievaardigheden onder de knie te krijgen te verkorten en tegelijkertijd de nauwkeurigheid en consistentie van injecties te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m spuitfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL insulin spuit met 29G naald</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge&nbsp; buis</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Gebruikt om 1x PBS voor weefselfixatie te bereiden</td></tr><tr><td>15 mL kegelvormige buis</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 mL kegelvormige buishouder</td><td>Meerdere bronnen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190 proof ethylalcohol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Gebruikt om 70% ethanol te bereiden</td></tr><tr><td>1x steriele PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microcentrifuge weefselopslagbuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Adeno-geassocieerd virus (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>Eenstrengs DNA (ssDNA) AAV werd verpakt om Cre recombinase als transgen te leveren, aangedreven door CMV-promotor</td></tr><tr><td>Alcoholdoekje</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Bead lysisbuis</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI (HaeIII) restrictie-enzym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bullet blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Ai14-afgeleide muizen uit JAX 007914 stam (genetische achtergrond: C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Muizen met Ai14 Cre-reporter allel werden gekocht bij JAX (catalogusnummer: 007914)</td></tr><tr><td>Wegwerp absorberende kussentjes</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>Dissectietang</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA-degradatie reagens (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extractie RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Voor RNA-digestie tijdens nucleïnezuurextractie</td></tr><tr><td>DNase-vrije RNase voor DNA-opruiming</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Voor RNA-digestie na nucleïnezuurextractie</td></tr><tr><td>dPCR Probe PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>dPCR software&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>QIAcuity Software Suite&nbsp;</td></tr><tr><td>Verhoogd platform</td><td>Meerdere bronnen</td><td>N/A</td><td>Een lege doos pipettenpunten werd gebruikt om de muisbegrenzer tijdens het opwarmen van de staart te verhogen</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Meerdere bronnen</td><td>N/A</td><td>Gebruikte model: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop software&nbsp;</td><td>Meerdere bronnen&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Gebruikte software: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Hogesnelheidscentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Metaal container</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Methylbutaan</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Moleculair water</td><td>Quality Biological</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Muisbuisbegrenzer</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Myfuge mini centrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Polymerasekettingreactie thermocyclus</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>Model: C1000 Touch</td></tr><tr><td>Precisiedoekjes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-wel</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR systeem</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Gebruikt voor DNA-extractie uit weefsels</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Gebruikt voor opruiming van genomisch DNA, en de isolatie van DNA uit kleine volumes van bloedprtocotol werd gebruikt voor DNA-extractie uit FACS-gesorteerd cellen</td></tr><tr><td>Knaagdier begrenzer kegel</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam doos</td><td>Meerdere bronnen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Oppervlaktereiniger en ontsmettingsmiddel</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Meerdere bronnen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Transfertang</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger &amp; Company</td><td>22220A</td><td>Model: Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

Veel aandoeningen tasten meerdere organen aan of hebben betrekking op verschillende delen van het lichaam, dus het is van cruciaal belang om therapieën systemisch toe te dienen om de aangetaste cellen op verschillende plaatsen aan te pakken. Intraveneuze injectie is een veelgebruikte systemische toedieningsroute in preklinische onderzoeken die behandelingen beoordelen die bedoeld zijn voor toediening in het hele lichaam. Bij volwassen muizen gaat het om de intraveneuze toediening van het therapeutische middel in de laterale staartaders van de muis. Als ze onder de knie zijn, zijn staartaderinjecties veilig en snel en vereisen ze alleen eenvoudige en algemeen verkrijgbare hulpmiddelen. Injecties met staartaders zijn echter technisch uitdagend en vereisen uitgebreide training en voortdurende oefening om de nauwkeurige afgifte van de beoogde dosis te garanderen.
Hier beschrijven we een gedetailleerd, geoptimaliseerd lateraal staart-ader injectieprotocol dat we hebben ontwikkeld op basis van onze ervaring en op basis van aanbevelingen die eerder door andere groepen waren gerapporteerd. Afgezien van de muismaskers en insulinespuiten, vereist dit protocol alleen reagentia en apparatuur die in de meeste laboratoria direct beschikbaar zijn. We ontdekten dat het volgen van dit protocol resulteert in consistent succesvolle intraveneuze toediening van adeno-geassocieerd virus (AAV) in de staartaders van niet-verdoofde muizen van 7-9 weken oud. Daarnaast beschrijven we de geoptimaliseerde protocollen voor de histologische detectie van fluorescerende reportereiwitten en vectorgenoom per diploïde genoom (vg/dg) kwantificering die wordt gebruikt om AAV-transductie en biodistributie te beoordelen. Het doel van dit protocol is om onderzoekers te helpen bij het gemakkelijk succesvol en consistent uitvoeren van staartaderinjecties, waardoor de oefentijd die nodig is om de techniek onder de knie te krijgen, kan worden verkort.

Zeven tot negen weken oude mannelijke muizen werden geïnjecteerd met AAV via laterale staartaderinjectie bij 1,5 ×10 12 vg/muis toegediend in een injectaatvolume van 150-200 μl. De ssDNA AAV die hier werd gebruikt, leverde een Cre-recombinasetransgen afgeleverd dat werd aangedreven door een CMV-promotor. De geïnjecteerde muizen waren homozygoot voor het Cre reporter Ai14-allel. Bij blootstelling aan Cre-recombinase brengen Ai14-allelbevattende cellen het fluorescerende tdTomato-eiwit tot expressie. Aangezien tdTomato-expressie wordt veroorzaakt door Cre-geïnduceerde genomische recombinatie, duiden tdTomato-expressiecellen op cellen die ofwel direct door de AAV werden getransduceerd of nageslachtcellen waren van getransduceerde cellen. De hier getoonde gegevens zijn van muizen die zijn geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre in een dosis van 1,5 × 1012 vg/muis, toegediend in 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). De muizen werden 28 dagen na de injectie geofferd en de weefsels werden verzameld zoals hierboven beschreven. Een paar skeletspieren en leverkwabben werden verteerd en hun cellen werden verzameld met behulp van FACS. Een paar leverkwabben werden onmiddellijk ingevroren met behulp van voorgekoeld methylbutaan voor nucleïnezuurextractie. Een paar skeletspieren en leverkwabben werden gefixeerd ingevroren voor histologische beeldvorming van fluorescerende tdTomato. tdTomaat werd diffuus tot expressie gebracht door de lever (Figuur 2A) en quadriceps (Figuur 2C), wat aangeeft dat AAV9 in grote lijnen verschillende regio's van beide weefsels bereikte en transduceerde.
DNA geëxtraheerd uit vers ingevroren lever en FACS-gesorteerde cellen werd gebruikt om vg/dg te kwantificeren met behulp van dPCR. Kwantificering van Vg/dg kan worden gebruikt om de injectieconsistentie en de transductie-efficiëntie van AAV in het geanalyseerde monster te beoordelen. De 1D-druppelverspreidingsdiagrammen van het vers ingevroren leverweefselmonster en FACS-gesorteerde cellen werden gebruikt om de geldigheid van de test te waarborgen (Figuur 3A,C). Het spreidingsdiagram toonde de aanwezigheid van positieve en negatieve partities, een duidelijke scheiding tussen de positieve en negatieve partities die een nauwkeurige bepaling van de detectiedrempel mogelijk maakt, en de aanwezigheid van niet-tot-weinig druppeltjes tussen de positieve en negatieve partities, wat de nauwkeurigheid van de dPCR-test kan verminderen. Het voldoen aan al deze criteria gaf aan dat de resultaten van de dPCR-test geldig waren. Het aantal Polr2a-genkopieën in elk monster werd gekwantificeerd om het aantal diploïde genomen van muizen te bepalen (2 Polr2a-genkopieën/diploïde genoom van muizen), en primers/sonde tegen de Cre-recombinase-transgensequentie werden gebruikt om het virale genoom te kwantificeren (1 transgenkopie/viraal genoom, tabel 1). De vg/dg-waarde werd gekwantificeerd voor het vers ingevroren leverweefselmonster en FACS-gesorteerde cellen en toonde de aanwezigheid van respectievelijk 187,7 vg/dg en 4,7 vg/dg in elk monster (figuur 3B,D). Monsters van PBS-geïnjecteerde muizen en niet-sjablooncontroles die geen nucleïnezuren bevatten, werden gebruikt als negatieve controles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het intraveneuze injectiestation. (A) Gereedschap dat nodig is om IV-injectie uit te voeren. Hier ziet u de (1) timer, (2) muisslangbeschermer, (3) ongesneden en (4) doorgesneden plastic fixussen, (5) alcoholdoekje, (6) lege pipetpuntjesdoos die wordt gebruikt als platform om de muisslanghouder omhoog te tillen, (7) wegwerpabsorberende pads, (8) conische slang van 15 ml met warm water, (9) slanghouder van 15 ml, (10) gaas en (11) insulinespuit. (B) De muis wordt eerst in de buishouder geplaatst. Vervolgens wordt de conus van de afgesneden restrainer ingebracht om een fixatiehuls rond de muis te creëren, als de muis te klein is om alleen door de buisrestrainer te worden vastgehouden. Zorg ervoor dat de ademhaling van de muis niet wordt belemmerd door de weerbarstten. De buisvergrendeling wordt bovenop het verhoogde platform geplaatst om de muisstaart in warm water te kunnen plaatsen. (C) Positionering van de staart van de muis en hoek van het vasthouden van de naald onmiddellijk voordat de injectie wordt uitgevoerd. Trek de staart naar achteren zodat de staart gestrekt is en de injectieplaats volledig horizontaal is. De naald is evenwijdig aan de staart en de ader en de afschuining is naar boven gericht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figuur 2: Detectie van fluorescerend reportereiwit na IV-injectie. Zeven tot negen weken oude mannelijke muizen met het Cre-reporter Ai14-allel werden IV geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre op 1,5 × 1012 vg/muis toegediend in 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) of PBS. Representatieve fluorescentiebeelden van muissecties (A) lever of (C) quadriceps na AAV9 toediening van Cre IV-injectie. (B) Lever- of (D) quadricepssecties van PBS-geïnjecteerde muizen werden afgebeeld om als negatieve controles te dienen. De weefsels werden 28 dagen na de IV-injectie verzameld en ingevroren. Na blootstelling aan Cre wordt fluorescerend tdTomato-eiwit tot expressie gebracht in getransduceerde cellen en nakomelingcellen van getransduceerde cellen. Secties van 10 μm dik werden afgebeeld bij een vergroting van 10x. Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figuur 3: Kwantificering van het vectorgenoom per diploïde genoom (vg/dg). 1D-spreidingsdiagram van kwantificering van dPCR-vectorgenomen in (A) leverweefsel of (C) FACS-gesorteerde cellen verzameld van muizen die zijn geïnjecteerd met AAV9-CMV-Cre of PBS. De spreidingsdiagrammen tonen de positieve en negatieve dPCR-verdelingen, evenals de detectiedrempel die wordt aangegeven door de horizontale lijn over de monsters. (B,D) kwantificering van vg/dg na kwantificering van de diploïde genomen en vectorgenomen van muizen in het (B) leverweefsel of (D) FACS-gesorteerde celmonsters. De hier getoonde resultaten zijn van een enkele AAV9-geïnjecteerde muis en een enkele PBS-geïnjecteerde muis met een technisch dPCR-duplicaat voor elke muis. Foutbalken geven het betrouwbaarheidsinterval van 95% voor elk monster aan. Afkortingen: NTC= Non-template control; dPCR = digitale PCR; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Abc</td>
			<td>Volgorde</td>
		</tr><tr><td>Cre voorwaartse primer</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre omgekeerde primer</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Cre sonde</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Polr2a voorwaartse primer</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a omgekeerde primer</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a-sonde </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Sequenties van primers en sondes die worden gebruikt voor de kwantificering van vg/dg. Cre-primers en sonde werden gebruikt om het vectorgenoom te kwantificeren. Polr2a-primers en sonde werden gebruikt om het diploïde genoom van muizen te kwantificeren.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

consistent-delivery-adeno-associated-virus-via-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Li, D., et al. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for the intrathecal injection of adeno-associated viruses (AAV) into the cerebrospinal fluid (CSF) of an awake mouse, covering syringe preparation, spinal alignment, and precise needle insertion. This method validates targeted gene delivery, supporting its potential for CNS therapies.

Intrathecal Delivery of Viruses in a Mouse Model for Treating Central Nervous System Diseases

Source:Pourshafie, N., et al. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (2018).In this video, a spinal and bulbar muscular atrophy or SBMA-affected mouse undergoes tail vein injection of recombinant AAV (Adeno-associated vectors) vectors carrying a plasmid encoding therapeutic microRNA. The vector produces microRNA that binds to mutant AR (Androgen receptor)-mRNA (messenger ribonucleic acid),...

Injecting Recombinant Adeno-Associated Vectors in a Spinal and Bulbar Muscular Atrophy Mouse Model

Source: Grames, M. S., et al. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the tail vein injection of recombinant adeno-associated virus (AAV) in rats. After injection into the lateral tail vein, the virus enters the bloodstream, circulates through the heart, and reaches the brain, where it enters neurons and facilitates target protein production for...

 Intravenous Administration of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in a Rat Model 

Hier beschrijven we de levering van microRNA met behulp van een recombinant adeno-associated virus serotype 9 in een muismodel van een neuromusculaire ziekte. Eenmalige perifere toediening in muizen geleid tot aanhoudende miRNA overexpressie in spieren en motorische neuronen, bieden een kans om studie miRNA functie en therapeutisch potentieel in vivo.

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

Het doel van de huidige studie was het ontwikkelen en valideren van de kracht en de veiligheid van de lever-adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) -gemedieerde genafgifte door gebruik te maken van een nieuwe subpiale genafgifte techniek bij volwassen muizen.

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.

Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Leer een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjecties bij volwassen muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) toe te dienen. Deze methode verbetert de reproduceerbaarheid van gentherapie-experimenten.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Meer video's verkennen