Name: Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe je LRRC8-kanaalactiviteit monitort met SE-FRET in levende HeLa-cellen. Deze methode maakt niet-invasieve observatie van aniontransport mogelijk onder osmotische stress en onthult regulatiemechanismen van volume-gevoelige kanalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Op FRET gebaseerde methode om LRRC8-kanaalactiviteit te bewaken zonder elektrofysiologie

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Camera DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Gift van C.F. Kaminski (University of Cambridge, UK)</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter wheel (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Filter cube CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Glas Bottom Culture Dishes 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Mammalian cervix carcinoma/ verkregen van Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Potassium chloride)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td>11640862</td><td></td></tr><tr><td>Light source LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml;nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml;nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Magnesium chloride)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope THUNDER Imager live cell</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Sodium chloride)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objective HC PL APO 63x/1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tumor necrosis factor (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (lrrc8/vrac) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie förster resonantie energieoverdracht (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We tonen FRET tussen geconjugeerde polymeer polydiacetylene (PDA) en fluorofoor aan het oppervlak van liposomen PDA voor de detectie van biomoleculen. PDA liposomen bevatte receptor moleculen op hun oppervlak voor biomoleculen te worden gebruikt als probes. Ligand-receptor interacties leiden tot veranderingen in de FRET efficiency tussen de fluorofoor en PDA die de basis van de meetmechanismes.

Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer

We beschrijven hier een verbeterde werkwijze Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) waarin we introduceren protease splitsingsplaats tussen de donor en acceptor fluorofoor sites. Deze modificatie kunnen wij specifieke LRET signalen die door membraaneiwitten plaats, waardoor de studie van membraaneiwitten zonder eiwitzuivering verkrijgen.

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn flexibele eiwitdomeinen die hun conformatie wijzigen als reactie op veranderingen in de omgeving. Ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) kan eiwitdimensies onder verschillende omstandigheden schatten. We presenteren een FRET-benadering om de structurele gevoeligheid van IDR te beoordelen in levende Saccharomyces cerevisiae-cellen onder hyperosmotische stress.

Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET

Dit protocol beschrijft een op BRET gebaseerde test voor het meten van de interacties van het CRAF-kinase met 14-3-3-eiwitten in levende cellen. Het protocol schetst stappen voor het voorbereiden van de cellen, het uitlezen van BRET-emissies en gegevensanalyse. Er wordt ook een voorbeeldresultaat gepresenteerd met identificatie van de juiste controles en probleemoplossing voor testoptimalisatie.

Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen

We beschrijven een protocol voor het toewijzen van de ruimtelijke spreiding van enzymatische activiteit voor enzymen die nicotinatmide adenine dinucleotide-fosfaat (NAD(P)H) + H + rechtstreeks in weefselmonsters genereren.

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Leer hoe je LRRC8-kanaalactiviteit monitort met SE-FRET in levende HeLa-cellen. Deze methode maakt niet-invasieve observatie van aniontransport mogelijk onder osmotische stress en onthult regulatiemechanismen van volume-gevoelige kanalen.

Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET) (Video) | JoVE Journal

Monitoring van leucine-rijke herhaling met 8-kanaals (LRRC8/VRAC) activiteit met behulp van gesensibiliseerde emissie Förster resonantie energieoverdracht (SE-FRET)

Meer video's verkennen