AAV-systemen en muismodellen voor het onderzoeken van ectopische expressie van neurod1 in getransduceerde cellen op subacute en chronische tijden na ischemische beroerte

We onderzoeken AAV-gemedieerde ectopische expressie van neurogene transcriptiefactoren als een mogelijke behandeling voor ischemische beroerte. Onze focus is om te zien of neurod1-expressie in cellen die GFAP tot expressie brengen tijdens de subacute en chronische fasen na een beroerte het aantal getransduceerde neuronen verhoogt en correleert met verbeteringen in de motorische functie. Recente bevindingen tonen aan dat genexpressie in de cortex varieert per regio met dezelfde AAV Ons onderzoek wees uit dat de GFAP-promotor actiever is in de mediale prefrontale cortex dan in de motorische cortex, wat aangeeft dat getransduceerde cellen anders reageren op specifieke promotors.

Therapieën met neurogene transcriptiefactoren moeten dus worden afgestemd op het doelhersengebied. Huidige uitdagingen zijn onder meer variabiliteit in de grootte van de beroertelaesie als gevolg van variabelen zoals de injectiesnelheden van ET-1 en transductie-efficiëntie tussen hersengebieden. AAV-titers en tropisme in hersengebieden en muizenstammen kunnen de transductie-efficiëntie beïnvloeden, wat van invloed is op de cellulaire beoordeling van ectopische neurod1-expressie na een beroerte.

De belangrijkste uitdaging bij het omzetten van astrocyten naar neuronen is het onderscheiden van geherprogrammeerde neuronen van reeds bestaande. Ons lab wil bevestigen dat deze herprogrammering in vivo gebeurt door nieuwe tools te ontwikkelen. Uiteindelijk proberen we te begrijpen hoe ectopische expressie van neuronale transcriptiefactor het herstel bij dieren met hersenletsel verbetert.

Haal om te beginnen het verdoofde dier uit de kamer en plaats het op een schoon oppervlak. Nadat u het operatiegebied van de muis hebt gereinigd, plaatst u de neus in de stereotactische neuskegel en stabiliseert u de schedel met behulp van oorstangen. Maak met behulp van een scalpelmes nummer 10 een verticale incisie evenwijdig aan het sagittale vlak van achter het middelpunt van de ogen tot aan het pariëtale bot.

Trek vervolgens de huid voorzichtig terug om de schedel bloot te leggen. Gebruik vervolgens een wattenstaafje om de fascia op de schedel te verstoren en laat de schedel drogen om de bregma volledig bloot te leggen. Boor met behulp van een stereotactische boor met hoge snelheid drie braamgaten op de coördinaten in de rechter sensorische motorische cortex.

Vervang vervolgens de boor door een spuit van 26 gauge die is uitgerust met een naald van 0.375 inch lang. Doe 1,5 microliter 400 micromolaire endotheline-1-oplossing opgelost in steriel PBS in de spuit. Laat een klein volume endotheline-1 los om een druppel aan de punt van de naald waar te nemen, wat zorgt voor een goede doorstroming.

Laat de punt van de naald langs de schedel in het middelste braamgat zakken zonder de dura mater te doorboren. Eenmaal uitgelijnd, laat u de naald een millimeter in de hersenen zakken. Gebruik de Hamilton-spuit om 0.1 microliter per keer af te geven en wacht een minuut voordat u de volgende 0.1 microliter injecteert.

Om te voorkomen dat de naald tussen en na de injecties verstopt raakt, laat u een kleine hoeveelheid endotheline-1 los totdat er een druppel aan de punt van de naald verschijnt. Veeg met een steriel wattenstaafje het overtollige endotheline-1 weg voordat u het injecteert. Hecht ten slotte de bovenliggende huid op de schedel met een 4-0 steriele hechtdraad om de wond te sluiten.

Na het verdoven van de met endotheline-1 behandelde muis, brengt u de muis over naar het stereotactische frame. Knip met een chirurgische schaar de hechtingen op de wond af. Verwijder met een tang het korstje en trek de huid terug om de schedel bloot te leggen.

Gebruik vervolgens een steriel wattenstaafje om het schedeloppervlak te drogen en de braamgaten te lokaliseren. Stel de manipulatorarmen van het stereotactische apparaat in. Plaats een naaldhouder met een spuit van 26 gauge met een naald van 0.375 inch lang.

Doe nu 3,4 microliter AAV-oplossing in de spuit. Laat de punt van de naald langs de schedel in het eerste, meest voorste braamgat zakken. Zorg ervoor dat de naald de dura mater niet doorboort en laat deze vervolgens op één millimeter in de hersenen zakken.

Injecteer met behulp van de Hamilton-spuit één microliter AAV-oplossing door 0.1 microliter per keer te doseren, zoals eerder aangetoond. Hecht vervolgens de bovenliggende huid op de schedel om de wond te sluiten met behulp van een 4-0 Polysorb polyester hechtdraad. Haal de muis uit het stereotactische frame en breng hem over naar een schone, voorverwarmde dierenkooi in de verkoeverkamer.