Name: Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in primaire T-cellen. Deze methode helpt onderzoekers genregulatie in immuunresponsen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Retrovirale transductie van gids-RNA voor genbewerking in Th17-differentiatie

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

```html
<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>100 mm cel- en weefselkweekbakje</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (vrij zuur, sterieel)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>24-well cel- en weefselkweekplaat</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48-well cel- en weefselkweekplaat</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A oplossing (1.000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-muis CD4 antilichaam (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e monoklonaal antilichaam (145-2C11), functionele graad, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 monoklonaal antilichaam (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) monoklonaal antilichaam (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Celteller</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Celzevener (40 μm)</td><td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Celzevener (70 μm)</td><td><a name="RANGE!B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5425&nbsp;R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini Plasmid Kit II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfectie Reagens</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-muis IL-17A antilichaam (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde oplossing</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix voor qPCR?+gDNA wiper?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Muis GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>reduced serum medium</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-muis CD4 antilichaam (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100531</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-muis CD25 antilichaam (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-muis CD4 antilichaam (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 muizen&nbsp;</td><td>Shanghai Model Organisms Center</td><td>Cat. NO. NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Proteïne, CF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Research Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Research Cell Sorter</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler PCR Systeem</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat oplossing (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis CD28 antilichaam (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IFN-&gamma; antilichaam (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IL-4 antilichaam (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Gezuiverd anti-muis IL-12/IL-23 p40 antilichaam (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>
```

retrovirale crispr/cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van th17-differentiatie in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

retroviral-crisprcas9-mediated-gene-targeting-for-study-th17

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay for performing gene editing in human T cells using the CRISPR-Cas9 technology. A mixture of primary CD4+ and CD8+ T cells is combined with a CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex, targeting specific genes for knockout. Upon electroporation, the sgRNA guides Cas9 to the target DNA sequence, creating precise cuts. These cuts are then repaired by the cell's non-homologous end-joining mechanism, leading to gene knockout.

A CRISPR-Cas9 Technique for Gene Editing in T Cells

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Vele experimentele systemen zijn gebruikt om de mechanismen reguleren T cel ontwikkeling en functie van een immuunrespons begrijpen. Hier een genetische benadering met behulp van retrovirale transductie wordt beschreven, dat is economisch, tijd efficiënt, en nog belangrijker, zeer informatieve bij het identificeren van de regelgeving paden.

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Elektroporatie van de volgende generatie is een efficiënte methode om humane Th17-cellen te transfecteren met kleine RNA's om genexpressie en celgedrag te veranderen.

Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Leer retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in primaire T-cellen. Deze methode helpt onderzoekers genregulatie in immuunresponsen te begrijpen.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Meer video's verkennen