Name: Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer het geoptimaliseerde Swiss roll-protocol voor intestinaal weefsel en immunofluorescentie met muismodellen. Deze methode visualiseert alle darmregio's in één paraffineblok voor consistente, reproduceerbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies K01 DK121869 aan ACE en deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) en de HCS-hoeksteensubsidies aan SAD en RS. Dit werk werd ondersteund door startup-fondsen van de Medical University of South Carolina (MUSC) tot ACE en werd ondersteund door het MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) en de COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de cel- en moleculaire beeldvormingskern bij MUSC.

Efficiënte Swiss Roll-methode voor hoogwaardige immunokleuring van darmweefsel

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
<li>Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieger%2C+J+%22Animal+models+of+allergic+disease%3A+Methods+and+protocols%22">Animal models of allergic disease: Methods and protocols</a>. , Springer US. New York, NY. (2021).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bswiss+roll%26%2334%3B%3A+A+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The &#34;swiss roll&#34;: A simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
<li>Lunnemann, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecum+axis+%28cecax%29+preservation+reveals+physiological+and+pathological+gradients+in+mouse+gastrointestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> J Vis Exp. (139), e58288(2018).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+AT+%22Histopathology%3A+Methods+and+protocols%22">Histopathology: Methods and protocols</a>. , Springer New York. New York, NY. (2014).</li>
<li>Yang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+mechanism+of+mucosal+barrier+erosion+in+the+pathogenesis+of+acquired+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis.</a> iScience. 26 (10), 107883(2023).</li>
<li>Dooley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+5b+is+required+for+proper+localization+of+the+intermicrovillar+adhesion+complex+in+the+intestinal+brush+border%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).</li>
<li>Danan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transit+amplifying+cells+require+mettl3+for+growth+factor+signaling%2C+kras+expression%2C+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).</li>
<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse tissue fixation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).</li>
<li>Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+preparation+techniques+for+histological+analysis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse.</a> Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat-induced+antigen+retrieval+following+inconsistent+formalin+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).</li>
<li>Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+three-dimensional+spatial+structure+in+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome.</a> PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).</li>
<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor weefselfixatie met behulp van de Swiss roll-techniek om de darmarchitectuur te behouden en nauwkeurige immunokleuring te bevorderen. Eenmaal onder de knie kan deze techniek worden gebruikt om een breed scala aan onderzoeksvragen op het gebied van darmfysiologie en celbiologie te onderzoeken19. Er zijn verschillende geoptimaliseerde Zwitserse walsmethoden gepubliceerd die zeer nuttig zijn20,21. Een voordeel van deze techniek is het gemak van het nauwkeurig openen van de darm op filtreerpapier. Hierdoor kan het weefsel plat worden gefixeerd, waardoor wordt voorkomen dat het weefsel tijdens het rollen naar binnen krult, wat vooral handig is bij het analyseren van ontstoken weefsel met verdikte spieren. Daarnaast is het essentieel om de cruciale rol van weefselsecties bij het bereiken van betrouwbare resultaten te benadrukken. Een goede doorsnede zorgt voor het behoud van de weefselarchitectuur en vergemakkelijkt een nauwkeurige immunokleuring, wat uiteindelijk bijdraagt aan het succes van stroomafwaartse analyses11. De geoptimaliseerde aanpak is minder moeilijk in vergelijking met andere protocollen en levert consistente resultaten op bij verschillende individuen. De techniek die in dit artikel naar voren wordt gebracht, biedt ook goed bewaarde weefselarchitectuur, veelzijdigheid en zeer reproduceerbare immunokleuring met behulp van diverse antilichamen.
Een cruciaal aspect van dit protocol is de fixatie- en verwerkingstijd. Onjuiste weefselfixatie en -verwerking kan histochemische analyses belemmeren. Weefsel dat te vast is, wordt broos, terwijl te weinig gefixeerd weefsel te zacht blijft. Zowel over- als ondergefixeerde weefsels zijn moeilijk te doorsnijden en brengen de immunokleuring in gevaar. Eenmaal ontleed op filtreerpapier, moet het weefsel onmiddellijk in formaline worden geplaatst om postmortale veranderingen te verminderen22. In dit protocol wordt muizenweefsel 's nachts in formaline gefixeerd. Verschillende studies hebben deze fixatietijd 20,23,24 gebruikt. Boenisch et al. toonden echter aan dat immunokleuring consistent is in weefsel dat tot 4 dagen in formaline is gefixeerd25. Optimalisatie van de fixatietijd en het fixeermiddel is vereist, afhankelijk van de gewenste analyses. Het fixeermiddel van Carnoy heeft bijvoorbeeld vaak de voorkeur voor slijmkleuring26. De keuze van fixeermiddelen en de duur van de fixatietijd moeten door elke onderzoeker worden geoptimaliseerd, afhankelijk van hun experimentele aanpak. Het gebruik van een geautomatiseerde tissueverwerker wordt aanbevolen om nauwkeurige en consistente verwerkingstijden te garanderen. Ons laboratorium gebruikt kleine pinnen om darmweefsel op zijn plaats te houden als rollen. Zonder pinnen kan het weefsel tijdens de verwerking loskomen. Omdat deze pinnen vrij klein en scherp zijn, moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen. We raden aan om een draadknipper te gebruiken om het scherpe uiteinde van de pin te verwijderen voordat u het weefsel verwerkt. Sommige histologiekernen accepteren geen weefsel met pinnen; Daarom is het het beste om dit voor gebruik te controleren. Een alternatieve benadering is om agar te gebruiken om weefsel te verankeren voordat27 wordt verwerkt, of cassettesponzen kunnen in cassettes worden gebruikt om rollen te helpen onderhouden.
Immunokleuring is een protocol dat optimalisatie vereist voor elk antilichaam. Het gebruik van knock-out-gevalideerde antilichamen wordt waar mogelijk aanbevolen. Deze methode voor weefselfixatie en -verwerking resulteert in heldere kleuring, waardoor een gemakkelijke identificatie van antilichaambinding mogelijk is in vergelijking met het achtergrondsignaal wanneer niet-gevalideerde antilichamen worden gebruikt. Fixatieve keuze, het ophalen van antigeen en verdunning van antilichamen kunnen de specificiteit van het antilichaam beïnvloeden. We raden onderzoekers aan het protocol zorgvuldig te beoordelen en te optimaliseren door de fixatie, het ophalen van antigeen en de incubatietijd voor elk antilichaam aan te passen. Om de beste resultaten te verkrijgen, moeten antilichamen worden getest in verschillende verdunningen om de optimale concentratie te bepalen en in verschillende buffers voor het ophalen van antigeen. Epitoopextractie verbetert de immunokleuring door methyleenbruggen te verbreken die tijdens fixatie zijn gevormd. In dit protocol wordt door warmte geïnduceerde epitoopextractie gebruikt in plaats van proteolytisch-geïnduceerde epitoopextractie, omdat enzymvertering waarschijnlijk de weefselmorfologie verstoort28. De meest voorkomende door warmte geïnduceerde buffers voor het ophalen van epitoop zijn citraatbuffer, tris-HCl en tris-EDTA, waarbij citraatbuffer het zachtst is voor weefselmorfologie29. De keuze van de buffer varieert en moet voor elk antilichaam worden bepaald. Veel buffers voor het ophalen van antigeen, blokkeringsoplossingen en verdunningsmiddelen tegen antilichamen zijn in de handel verkrijgbaar. Deze oplossingen kunnen echter extreem duur en onbetaalbaar zijn. We leverden recepten van veelgebruikte oplossingen voor het ophalen van antigeen en blokkerings- en antilichaamverdunningsoplossingen om kosteneffectiviteit te garanderen. 
Een beperking van deze methode is dat fixatie en verwerking weefsel kunnen veranderen en epitopen kunnen maskeren. Een alternatieve benadering is om vers ingevroren weefsel te immunokleuren. Vers ingevroren weefsel wordt snel ingevroren, waardoor blootstelling aan toxische fixeermiddelen wordt vermeden, de eiwitstructuur behouden blijft en de toegankelijkheid van sommige epitopen wordt verbeterd. De weefselarchitectuur en morfologie zijn echter slechter dan die van gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel. Verdere uitdagingen van vers ingevroren weefsel zijn onder meer de materialen en logistiek die nodig zijn om bevroren blokken en dia's te verdelen en op te slaan. Analyse van Zwitserse rollen versus stroken darmweefsel toont verschillen in hoogte en breedte van villi en verschillen in immuuncellen in de lamina propria, zoals beschreven in een eerder rapport30. Deze resultaten suggereren dat intestinale Zwitserse broodjes sommige darmkenmerken veranderen, waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van experimenten. Bovendien is hervalidatie van antilichamen vereist, omdat veel antilichamen die specifiek binden aan in formaline gefixeerd paraffine ingebed weefsel niet goed kleuren in vers ingevroren weefsel31.
Immunokleuring van darmweefsel kan worden gebruikt om een breed scala aan vragen over gastro-intestinale celbiologie en fysiologie te beantwoorden. Deze techniek wordt veel gebruikt om epitheliale veranderingen te identificeren in de setting van darmontsteking, na bacteriële infectie en tijdens kankerprogressie. De hier gepresenteerde methode is ideaal voor het behoud van darmweefsel, omdat deze kosteneffectief, technisch niet uitdagend en zeer reproduceerbaar is. Om de beste resultaten te garanderen, moedigen we optimalisatie van de stappen die in dit protocol worden beschreven aan op basis van het experimentele ontwerp en de hypothese die wordt getest.

De cellulaire architectuur van de darm vormt een unieke uitdaging bij het behouden van de structurele integriteit wanneer darmweefsel wordt bewaard voor immunokleuring. De dunne darm bestaat uit langwerpige vingerachtige structuren die bekend staan als villi1. Deze villi raken vaak misvormd tijdens inbeddingsprocessen. Ervoor zorgen dat onderzoekers technieken hebben om darmen goed in te bedden om dwarsdoorsneden te bereiken, waardoor visualisatie van alle delen van de darm mogelijk is, evenals de lagen waaruit de darm bestaat (d.w.z. muscularis propria, slijmvlies en de serosa), is cruciaal voor robuuste experimentele analyse2. Onvoldoende fixatie, overmatige fixatie en onjuiste weefselbehandeling zullen de weefselintegriteit in gevaar brengen, wat resulteert in onbedoelde schade aan het darmepitheel 3,4. Het beschadigen van het darmepitheel tijdens deze stappen kan de kwaliteit van latere analyses, zoals immunofluorescentie, aanzienlijk verminderen, ongeacht de werkzaamheid van immunohistochemische protocollen en gebruikte antilichamen.
Immunokleuring is, net als een goede weefselfixatie, een belangrijk onderdeel van biomedisch onderzoek. Als het goed wordt gedaan, kan immunokleuring voorheen onbekende aspecten van de cellulaire structuur en functie verlichten. Immunofluorescentiekleuring van paraffinesecties kan een uitdaging zijn vanwege fysisch-chemische veranderingen als gevolg van het fixatie- en paraffine-inbeddingsproces5. Fixatie en inbedding van paraffine resulteren in antigeenmaskering die de immunofluorescentiedetectie van interessante epitopen kan verstoren6. Vertraagde fixatie kan proteolytische degradatie induceren, wat resulteert in een verzwakte of afwezige kleuring van kritieke epitopen7. Bovendien zijn antilichamen vaak onnauwkeurig met een hoge achtergrond. Immunokleuringsprotocollen die consistente en specifieke antilichaambinding en een hoge signaal-ruisverhouding bevorderen, kunnen waardevolle informatie opleveren voor onderzoekers. 
Hier bieden we een uitgebreid protocol dat is ontworpen om immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss roll-voorbereiding8 en immunokleuring. Het protocol legt de nadruk op richtlijnen om de integriteit van de darm te behouden en heeft tot doel onderzoekers een robuuste methodologie te bieden om de kwaliteit en betrouwbaarheid van immunofluorescentiebeeldvormingsonderzoeken te verbeteren. We hebben ook geprobeerd kosteneffectieve middelen te gebruiken, waaronder filterpapier en zelfgemaakte antigeenextractie, blokkeringsoplossingen en antilichaamverdunningsmiddelen om het protocol toegankelijker te maken voor laboratoria die mogelijk beperkte middelen hebben. Zoals voor alle experimentele protocollen, moeten onderzoekers het huidige protocol optimaliseren op basis van hun experimentele aanpak en interessegebieden.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Dikt Whatman papier</td></tr><tr><td>Charged glass slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting pins size 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Freezer gloves</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Slide Warmer</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64111-04</td><td>Clearing reagent</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Large cassettes</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-on-mouse blocking reagent</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Mouse-on-mouse block</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Cooker</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong gold antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Reverse action forceps</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Slide Staining Set</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Solvent Resistant Dishes and Metal Frame</td></tr><tr><td>Small cassettes</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Blocking buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Wipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd protocol voor intestinale swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

De darm is een complex orgaan dat bestaat uit de dunne en de dikke darm. De dunne darm kan verder worden onderverdeeld in twaalfvingerige darm, jejunum en ileum. Elk anatomisch gebied van de darm heeft een unieke functie die tot uiting komt in verschillen in de cellulaire structuur. Het onderzoeken van veranderingen in de darm vereist een diepgaande analyse van verschillende weefselregio's en cellulaire veranderingen. Om de darm te bestuderen en grote stukken weefsel te visualiseren, gebruiken onderzoekers vaak een techniek die bekend staat als intestinale Swiss rolls. Bij deze techniek wordt de darm verdeeld in elk anatomisch gebied en in een vlakke richting gefixeerd. Vervolgens wordt het weefsel zorgvuldig opgerold en verwerkt voor paraffine-inbedding. Een goede weefselfixatie en -oriëntatie is een laboratoriumtechniek die vaak over het hoofd wordt gezien, maar is van cruciaal belang voor stroomafwaartse analyse. Bovendien kan onjuist Zwitsers rollen van darmweefsel het fragiele darmepitheel beschadigen, wat leidt tot een slechte weefselkwaliteit voor immunokleuring. Zorgen voor goed gefixeerd en goed georiënteerd weefsel met intacte celstructuren is een cruciale stap die zorgt voor een optimale visualisatie van darmcellen. We presenteren een kosteneffectieve en eenvoudige methode voor het maken van Zwitserse broodjes om alle delen van de darm in een enkel in paraffine ingebed blok op te nemen. We beschrijven ook geoptimaliseerde immunofluorescentiekleuring van darmweefsel om verschillende aspecten van het darmepitheel te bestuderen. Het volgende protocol biedt onderzoekers een uitgebreide gids voor het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss-roll-techniek en immunokleuring. Door gebruik te maken van deze verfijnde benaderingen blijft de ingewikkelde morfologie van het darmepitheel behouden en wordt een beter begrip van de darmfysiologie en pathobiologie bevorderd.

Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven12. Met behulp van de geoptimaliseerde methode bevatten intestinale Zwitserse broodjes alle drie de segmenten van de dunne darm en de dikke darm op één objectglaasje. Door de hele darm op een objectglaasje te plaatsen, kunnen onderzoekers veranderingen in alle delen van de darm analyseren en besparen ze kosten op het doorsnijden en kleuren van reagentia (Figuur 1). Ook helpt het gelijktijdig blootstellen van alle darmsegmenten aan dezelfde oplossingen bij immunokleuring om nauwkeurige resultaten te garanderen. De H&E-microfoto toont de bewaarde darmarchitectuur van alle delen van de dunne darm en de dikke darm (figuur 2). Meting van duodenale villi toonde geen significant verschil in villi-hoogte in ongeopend darmweefsel in vergelijking met deze Zwitserse rolmethode, wat suggereert dat het openen van de darm de weefselarchitectuur niet verstoort (Figuur 2D). Immunokleuring van intestinale Zwitserse rolletjes toont de verschillende lagen van de darm en de gehele villeuze crypte-as. De fluorescerende beelden tonen lage achtergrondniveaus van de primaire en secundaire antilichaamkleuring en geven duidelijk de individuele cellen weer die in het epitheel aanwezig zijn. Figuur 3 toont de morfologie van verschillende darmsegmenten en kleuring voor bekercellen (MUC2-positieve cellen)13, het apicale membraan (γ-ACTINE)14, het laterale membraan van epitheelcellen (E-CADHERIN)15 en kernen. Dit protocol is geschikt voor het identificeren van veel verschillende cellulaire compartimenten, waaronder proliferatieve cellen (PCNA)16, interstitium (LAMININ; Figuur 4A) 17, het lysosomale domein (LAMP1)14 en het epitheel (β-CATENINE; Figuur 4B) 18. okt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow voor de bereiding en verwerking van intestinale Swiss rolls. (A) Darmsegmenten worden gespoeld met een spuit met PBS en vervolgens gewassen in PBS. (B) Nat darmweefsel wordt vervolgens op droog filtreerpapier gelegd. (C) De darm wordt in de lengterichting opengesneden op filtreerpapier en (D) voorzichtig gespreid. (E) Een stuk filtreerpapier wordt op de geopende darm gelegd en de darm wordt voorzichtig tussen het filtreerpapier geklemd en geniet. De darmsegmenten worden 's nachts gefixeerd en (F) wordt met een tang gerold. (G) De darm wordt voorzichtig losgemaakt van de pincet met omgekeerde werking en (H) heeft het uiterlijk van een rozet. (Ik, J) Darmweefsel wordt vastgezet en in een grote cassette geplaatst. (K) Alle vier de darmsegmenten worden in dezelfde cassette geplaatst voor weefselverwerking en inbedding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Figuur 2: Hematoxyline- en eosinekleuring van alle vier de segmenten van de darm. (A) Tegelscannen demonstreert het vermogen om de hele darm in een enkel objectglaasje te visualiseren met individuele Zwitserse rollen van de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm. (B) Microfoto van een inwendige Zwitserse rol en (C) hogere vergroting inzet om villi en crypte-architectuur te tonen. (D) Kwantificering van de lengte van de dunne darmvlokken in de toont geen significant verschil tussen Zwitsers opgerold weefsel en ongeopend weefsel. Schaalbalken = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Figuur 3: Immunofluorescentiekleuring van alle vier de segmenten van de darm. Volwassen C57BL/6J-controlemuizen werden immunogekleurd voor kernen (cyaan), de laterale membraanmarker, E-CADHERIN (groen), bekercellen geïdentificeerd door MUC2 (geel) en de apicale borstelgrensmarkering, γ-ACTIN, (magenta). Schaalbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Figuur 4. Immunofluorescentiekleuring van de darm. (A) Een representatieve microfoto van immunofluorescentiekleuring van de muizendarm benadrukt kernen (cyaan), proliferatieve cellen, PCNA (groen) en lamina propria, LAMININ (magenta). (B) Immunofluorescentiebeeld dat kernen (cyaan), de celmembraanmarker β-CATENIN (groen) en de lysosoommarker LAMP1 (magenta) in de darm identificeert. Schaalbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De darm is van vitaal belang voor de spijsvertering en opname. Elke regio - twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, dikke darm - vervult verschillende functies vanwege unieke cellulaire structuren. Het bestuderen van darmfysiologie vereist een nauwgezette weefselanalyse. Dit protocol schetst weefselfixatie en -verwerking met behulp van de Swiss roll-techniek, waardoor nauwkeurige immunokleuring wordt gegarandeerd door middel van de juiste weefselconservering en -oriëntatie.

Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

optimized-protocol-for-intestinal-swiss-rolls-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video illustrates an immunofluorescence-based method for visualizing intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections. Within the intestinal villi, the co-localization of green fluorescence at the luminal tip with an extended red rootlet mass indicates the presence of tuft cells.

An Immunofluorescence-Based Method for Visualizing Tuft Cells in Jejunum Cryosections

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Intestinale epitheliale stamcellen (ISC) worden vermengd met Paneth cellen. Deze cellen zijn gedifferentieerd nageslacht van de ISC, die ISC ondersteunen en antibacteriële bescherming. Hier laten we zien hoe we gebruikten conditionele transgene muismodellen aangetoond dat Paneth cellen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de intestinale epitheel.

Protocollen voor het analyseren van de rol van Paneth Cellen in het regenereren van de muizen darm met behulp van voorwaardelijke<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Modellen

Nauwkeurige identificatie en locatie van epitheelcellen langs de intestinale slijmvlies essentieel verschillende cellijnen definiëren. Een goede beeldvorming van darmweefsel is van cruciaal belang voor de identificatie van eiwit expressie patronen met maximale resolutie. Dit onderzoek heeft als doel om de optimale methoden en voorwaarden voor de verwerking van de muis intestinale weefsels af te bakenen.

Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses

Presenteren wij protocollen voor isolatie van intestinale 3D structuren uit weefsel in vivo en in vitro kelder matrix ingesloten organoids, en detail verschillende fixatie en kleuring van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor immuno-labeling van microtubuli, centrosomal en regulates eiwitten zo goed zoals markeringen met inbegrip van de stamcel proteïne Lgr5 cel.

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

Kuga et al. ontdekt dat fosforylatie-status specifieke antilichamen tegen de actine bindende eiwit girdin phosphorylated op tyrosine 1798 (pY1798) kunnen worden gebruikt om het label tuft cellen (TCs). Dit protocol staat robuuste visualisatie van televisiecamerasystemen gebruik immunefluorescentie verkleuring van de vrij zwevende jejunum cryosecties met pY1798 antilichamen.

Gebruik van Anti-phospho-girdin antilichamen te visualiseren van intestinale Tuft cellen in zwevende muis Jejunum cryosecties

Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.

Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Dit protocol beschrijft een immunokleuringsmethode voor de hele maag, aangepast van de "Swiss roll"-techniek die oorspronkelijk voor de muisdarm is ontwikkeld.

Verbeterde ruimtelijke mapping van maagspierlagen van de muis met behulp van een aangepaste Swiss roll-techniek

Leer het geoptimaliseerde Swiss roll-protocol voor intestinaal weefsel en immunofluorescentie met muismodellen. Deze methode visualiseert alle darmregio's in één paraffineblok voor consistente, reproduceerbare resultaten.

Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

Meer video's verkennen