Name: Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Leer FISH-technieken voor robuuste detectie van genamplificatie in FFPE-weefselmonsters. Deze geoptimaliseerde methode verbetert datakwaliteit en biedt inzicht in kankerprogressie door oncogenamplificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.W. is een geleerde van en wordt ondersteund door het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR210034)

Dit onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. Voorafgaand aan de operatie werd van alle patiënten geïnformeerde toestemming verkregen.
1. Reagentia en materiaalvoorbereiding
<ol><li>Bereid de 0,2 N natriumchloride (HCl) oplossing in een zuurkast door langzaam 8,212 ml HCl (37% m/w of 12,1 N) toe te voegen aan 491,788 ml ddH2O. Bewaren bij kamertemperatuur (RT). LET OP: Voeg langzaam zuur toe aan het water. Voeg geen water toe aan zuur.</li>
	<li>Bereid 10 mM citroenzuuroplossing (pH 6.0) door 1.47 g Tri-natriumcitraat (dihydraat) op te lossen in 400 ml ddH2O. Gebruik HCl om aan te passen aan pH 6.0 en breng vervolgens het uiteindelijke volume op 500 ml met ddH2O. Bewaar de buffer bij RT.</li>
	<li>Bereid de 10% Tween-20 oplossing voor door 100 μL Tween-20 toe te voegen aan 900 μL ddH2O. Bewaar het bij RT.</li>
	<li>Bereid de 10% IGEPAL oplossing door 5 ml IGEPAL CA-630 toe te voegen aan 45 ml ddH2O. Bewaar het bij RT.</li>
	<li>Bereid de 20x SSC-oplossing (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat) voor door 44,1 g trinatriumcitraat (dihydraat) en 87,65 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 900 ml ddH2O. Gebruik HCl om aan te passen aan pH 7,0 en breng vervolgens het uiteindelijke volume naar 1000 ml met ddH2O. Bewaar de buffer bij RT.</li>
	<li>Bereid de 2x SSC-oplossing voor door 100 ml 20x SSC toe te voegen aan 900 ml ddH2O. Voeg indien nodig 0,5 ml conserveermiddel toe (Materiaaltabel). Bewaar het bij RT.</li>
	<li>Bereid de hybridisatiebuffer van de sonde voor door 910 μL ddH2O, 500 μL 20x SSC, 50 μL 10% Tween-20, 40 μL RNase A, 1 ml 50% dextraansulfaat en 2,5 ml formamide te mengen. Doseer ze in 1 ml en bewaar ze bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid de 0,4x SSC met 0,3% IGEPAL-oplossing door 100 ml 2x SSC, 15 ml 10% IGEPAL en 385 ml ddH2O te mengen. Bewaar het bij RT.</li>
	<li>Bereid de 2x SSC met 0,1% IGEPAL oplossing door 5 ml 10% IGEPAL toe te voegen aan 495 ml 2x SSC-oplossing. Bewaar het bij RT.</li>
	<li>Bereid de proteïnase K-verteringsbuffer vers voor gebruik door 1 μL proteïnase K toe te voegen aan 99 μl Tris-EDTA-buffer.</li>
	<li>Bereid 1 mg/ml DAPI-opslagbouillon voor door 1 mg DAPI op te lossen in 1 ml ddH2O. Bewaar het bij -20 °C en uit de buurt van licht. Bereid de DAPI-werkoplossing voor door 1 μL van de DAPI-opslagvoorraad toe te voegen aan 999 μL 2x SSC-oplossing. Verwijderd houden van licht tot gebruik.</li>
</ol>2. Voorbehandeling van de steekproef
OPMERKING: De dia die hier wordt gebruikt, bevat het preparaat.
<ol><li>Rijp de glijbaan bij 60-90°C gedurende 20 minuten of een nacht (Figuur 1). OPMERKING: Deze stap vergemakkelijkt het smelten van paraffine. Meestal is 20 minuten verwarmen voldoende. Het kan worden verlengd tot 's nachts om aan het schema te voldoen.</li>
	<li>Ontparaffiniseer het objectglaasje door het gedurende 10 minuten onder te dompelen in xyleen of zijn vervangers in een Coplin-pot. Herhaal deze stap met vers xyleen of zijn vervangers. Voer alle volgende voorbehandelings- en wasstappen uit in een Coplin-pot. OPMERKING: Xyleenvervangers zijn veilige en milieuvriendelijke alternatieven voor xyleen. Een van de vervangers (zie Materiaaltabel) presteert net zo goed als xyleen, zo niet beter. Hoewel xyleenvervangers minder geur produceren dan xyleen, wordt aanbevolen om het in een zuurkast te gebruiken. Als xyleenvervangers niet toegankelijk zijn, zijn alle procedures compatibel met deparaffinisatie op basis van xyleen zonder enige wijzigingen.</li>
	<li>Spoel de xyleenvervanger met 100% ethanol gedurende 5 minuten af.</li>
	<li>Hydrateer de objectglaasje met 70% ethanol onderdompeling gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Dompel het objectglaasje gedurende 20 minuten onder in 0,2 N zoutzuur (HCl) bij RT. OPMERKING: HCl extraheert effectief in zuur oplosbare eiwitten, zoals basische nucleaire eiwitten, om de DNA-toegankelijkheid voor FISH-sondeste verbeteren 11.</li>
	<li>Dompel het objectglaasje onder in 10 mM hete citroenzuuroplossing en incubeer bij 90-95 °C gedurende 20 min. OPMERKING: Citroenzuurbehandeling onder hoge temperaturen extraheert op dezelfde manier in zuur oplosbare eiwitten. Van beide zuurbehandelingen wordt gedacht dat ze extracellulaire matrixeiwitten extracellulaire matrixeiwitten extrariseren om autofluorescentie te verminderen12. Het wordt aanbevolen om de citroenoplossing voor te verwarmen tot het gewenste temperatuurbereik voordat deze op het objectglaasje wordt aangebracht. Magnetron kan een handige manier zijn om dit te doen. Een waterbad, zoals bij een sous vide koker, is de meest effectieve en economische oplossing voor incubatie op hoge temperatuur.</li>
	<li>Spoel het glaasje kort af in 2x SSC om de pH te neutraliseren.</li>
	<li>Verteer het weefsel door 100-200 μL (genoeg om het weefsel volledig te bedekken, afhankelijk van de grootte van de sectie) proteïnase K-verteringsbuffer toe te voegen en gedurende 1 minuut bij RT te incuberen. OPMERKING: Proteïnase K-vertering verhoogt de toegankelijkheid voor FISH-sondes verder en vermindert autofluorescentie. De tijd van de spijsvertering moet worden geoptimaliseerd op basis van de weefseltypes. In de meeste gevallen is 1 minuut spijsvertering voldoende. Oververtering leidt tot halo-vormige kernmorfologie en de verteringstijd moet worden verkort.</li>
	<li>Stop onmiddellijk met de vertering van proteïnase K en dehydrateer het objectglaasje door het gedurende 2 minuten onder te dompelen in 70% ethanol, gevolgd door een behandeling met 85% en 100% ethanol gedurende elk 2 minuten.</li>
</ol>3. FISH en beeldvorming
<ol><li>Bereid de FISH-hybridisatiemix voor door 2 μL FISH-sondemateriaal te verdunnen met 8 μL hybridisatiebuffer en breng het vervolgens aan op het objectglaasje. Dek het monster af met een dekglaasje. OPMERKING: De totale gebruikte FISH-sondevoorraad varieert van 0,5-4 μl, afhankelijk van de beeldkwaliteit. Als het signaal te laag is, verhoog dan de sonde-ingang. Verminder de invoer van de FISH-sonde als de achtergrond te hoog is, vooral wanneer fluorescerend puin buiten de kernen wordt waargenomen. De hybridisatiebuffer kan de buffer zijn die bij de in de handel gekochte sondes wordt geleverd of die is voorbereid zoals in sectie 1.</li>
	<li>Plaats de objectglaasjes op een hete plaat, zoals een hybridisatiesysteem met een glijgracht, om DNA te denatureren bij 75 °C gedurende 2-5 minuten. Breng het glaasje vervolgens over op een andere kookplaat op 37 °C om een nacht te hybridiseren. NOTITIE: Als de kookplaat een waterbak of reservoir heeft om de luchtvochtigheid tijdens hybridisatie op peil te houden, is het afdichten van het dekglaasje met rubbercement niet nodig.</li>
	<li>Dompel het objectglaasje na hybridisatie in 40-60 °C verwarmd 0,4x SSC met 0,3% IGEPAL CA-630 wasbuffer en verwijder vervolgens voorzichtig het dekglaasje. Ga door met wassen gedurende twee keer gedurende 5 minuten in het donker, met agitatie gedurende de eerste 10-15 s. NOTITIE: Door de schuif in de wasbuffer te dompelen, komt het dekglaasje voorzichtig los.</li>
	<li>Spoel de dia in SSC met 0,1% IGEPAL CA-630 gedurende 5 minuten bij RT in het donker, met agitatie gedurende de eerste 10-15 s.</li>
	<li>Om autofluorescentie te doven, behandelt u het objectglaasje met de autofluorescentieblusset (zie Materiaaltabel) door 150 μL reagens (50 μL + 50 μL + 50 μL reagentia A, B, C) gedurende 2-5 minuten aan te brengen en vervolgens gedurende 5 minuten met 2x SSC te wassen. OPMERKING: Dit is een optionele stap. Autofluorescentie van weefsel is voornamelijk afkomstig van extracellulaire matrixcomponenten, zoals collageen en elastine. Het wordt ook aanzienlijk beïnvloed door lysosomen en mitochondriën vanwege hun lipofuscine-, NADPH- en flavine-co-enzymgehalte. Aldehydefixatie en aanwezigheid van bloedcellen kunnen ook de autofluorescentie goed verhogen13,14.</li>
	<li>Vlek de glaasje 10 minuten met DAPI. Spoel de dia af met 2x SSC-buffer gedurende 5 min. OPMERKING: Als het objectglaasje niet wordt behandeld met de autofluorescentie-blusset, kan de DAPI-kleuring worden teruggebracht tot 2 minuten.</li>
	<li>Dompel de dia snel niet langer dan 1 s in gedeïoniseerd water en droog hem vervolgens snel af door extra vocht op te nemen met keukenpapier. OPMERKING: Dit is een optionele stap. Gedeïoniseerde waterbehandeling voorkomt effectief de afzetting van zoutkristallen van de SSC-buffer op het objectglaasje en verbetert de beeldkwaliteit. Onder dergelijke omstandigheden met weinig ionen zijn de waterstofbruggen tussen de FISH-sonde en het beoogde DNA echter verzwakt, wat leidt tot dissociatie van de sonde en signaalverlies. Daarom is het van cruciaal belang om de waterbehandelingsstap voor een zeer korte tijd vol te houden.</li>
	<li>Droog de dia af en monteer deze vervolgens met antifade-montagemedia. Verzegel het dekglaasje met nagellak voordat u het beeldmateriaal maakt. OPMERKING: Als het objectglaasje is behandeld met een autofluorescentie-doveningsreagens, monteer het objectglaasje dan met een antifade-montagemedium volgens de instructies van de fabrikant. Bovendien moet, afhankelijk van het type montagemedia, verhardend of niet-hardend, het monster 1-24 uur worden uitgehard voordat het wordt verzegeld en beeldvorming. Het wordt aanbevolen om het monster ten minste 's nachts uit te harden om de beste brekingsindex voor beeldvorming te bereiken.</li>
	<li>Gebruik een 60× olielens om het fluorescentiesignaal vast te leggen. Gebruik het DAPI-kanaal om de scherpstelling aan te passen. Zorg ervoor dat u meerdere Z-stapels verkrijgt. Doorgaans zijn 5-10 z-stacks met een interval van 1 μm voldoende. Voer een maximale 3D-projectie uit om de beste resolutie te bereiken. Pas deconvolutie of andere algoritmen voor het wissen van de achtergrond toe om de beeldkwaliteit verder te verbeteren.</li>
</ol>

Verbetering van FISH-analyse voor oncogene drijfveren in kankerweefselmonsters

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Dimension Genomics Inc.

FISH is een snelle en betaalbare optie voor cytogenetische diagnose. Vooral bij het bepalen of ecDNA aanwezig is bij kanker, blijft FISH-bewijs de gouden standaard1. FISH in FFPE-weefsel maakt een snelle bepaling van de genstatus in de biopsiemonsters van een patiënt mogelijk, waardoor een snellere diagnose kan worden gesteld en veranderingen tijdens de voortgang van de ziekte kunnen worden gevolgd. Deze techniek is vooral waardevol voor het testen van klinische monsters die al zijn verzameld voor pathologie.
Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste stap is een grondige deparaffinisatie. Resterende paraffine kan de hybridisatie van FISH verstoren. Als het monster er na stap 2 nog steeds wasachtig uitziet, moet het opnieuw worden behandeld met vers xyleen of zijn vervangers.
Ten tweede zijn eiwitextractie en -vertering van cruciaal belang. Deze processen verbeteren niet alleen de toegankelijkheid van het DNA tot de FISH-sonde, maar verminderen ook de autofluorescentie aanzienlijk. Dit protocol omvat drie deproteinisatiestappen. Hoewel de behandeling met 0,2 N HCl en 10 mM citroenzuur eenvoudig is, kan de proteïnase K-vertering geoptimaliseerd moeten worden. Oververtering is de meest voorkomende fout bij het gebruik van proteïnase K, wat resulteert in halo-vormige kernen. Het verkorten van de verteringstijd zal de morfologie van de kernen verbeteren. Bovendien wordt aanbevolen om niet meer dan vier monsters tegelijk te verteren om het tijdsverschil tussen het eerste en het laatste monster te minimaliseren. Het is belangrijk op te merken dat zelfs een intacte kern er bij hoge vergroting en hogeresolutiemicroscopie uit kan zien als een halo. Dit komt omdat de kern zich niet op hetzelfde brandpuntsvlak bevindt. Daarom wordt voorgesteld om meerdere Z-stacks te nemen en een maximale projectie uit te voeren om de nucleaire morfologie te inspecteren.
Ten slotte wordt het blussen van autofluorescentie aanbevolen. Hoewel zuurextractie en proteïnase K-vertering de eiwitafgeleide achtergrond aanzienlijk kunnen verminderen, kunnen fluorescerende metabolieten nog steeds de beeldvormingskwaliteit beïnvloeden.
Hoewel FISH een ongeëvenaarde ruimtelijke resolutie biedt bij het identificeren van focale genamplificatie, heeft het beperkingen. Ten eerste zijn de inhoud en doorvoer laag in vergelijking met op PCR of next-generation sequencing (NGS) gebaseerde benaderingen. Doorgaans kunnen één tot drie FISH-sondes van verschillende kleuren op een enkel objectglaasje worden aangebracht zonder gespecialiseerde apparatuur. Desalniettemin heeft de vooruitgang in automatiseringstechnologieën FISH met een hoge inhoud en een hoge doorvoer, zoals in situ sequencing21, haalbaar gemaakt. Ten tweede vereist het ontwerp van de FISH-sonde voorafgaande informatie. De voortdurende inspanningen om terugkerende focale amplificatiegebeurtenissen bij kanker te identificeren, hebben de creatie van vooraf ontworpen FISH-panelen voor laboratorium- en klinische toepassingen mogelijk gemaakt. Oncogenen uit de MYC-familie worden bijvoorbeeld vaak geamplificeerd als ecDNA bij kleincellige longkanker om resistentie tegen chemotherapie te mediëren. Daarom kan een FISH-panel gericht op MYC-, MYCL- en MYCN-genen de bepaling van behandelingsreacties in biopsieën versnellen. Ter vergelijking: NGS maakt een meer onbevooroordeelde screening van interessante genen mogelijk. Van de op NGS gebaseerde technologieën kan echter alleen sequencing van het hele genoom met rekendure analyse22 ecDNA karakteriseren.
Samenvattend presenteren we robuuste en uitgebreide instructies voor het onderzoeken van focale genamplificatie in FFPE-monsters. Door het FISH-signaalpatroon te onderzoeken, wordt ondubbelzinnig duidelijk of en hoe een genlocus wordt versterkt. We verwachten de integratie van machine learning in de beeldanalyse23 van interfasekernen om cytogenetische informatie te extraheren met betrekking tot het aantal kopieën en de vorm van amplificatie (chromosoom of ecDNA), waardoor het moleculaire diagnoseproces wordt gestroomlijnd en ons begrip van pathogenetische mechanismen bij kanker wordt verbeterd.

De studie van focale oncogenamplificatie is cruciaal omdat het de vorming, progressie entherapieresistentie van kanker stimuleert. Belangrijk is dat oncogenen en immunoregulerende genen kunnen amplificeren als extrachromosomale DNA's (ecDNA), waarvan de asymmetrische overerving genetische heterogeniteit bij kanker bevordert. ecDNA is in verband gebracht met therapieresistentie en ongunstige klinische resultaten 4,5,6.
In formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters vertegenwoordigen een enorme archiefbron in pathologielaboratoria en bieden overvloedige informatie voor retrospectieve studies. Het extraheren van moleculaire gegevens uit FFPE-monsters door middel van PCR of sequencing is echter een uitdaging vanwege nucleïnezuurfragmentatie, degradatie en verknoping tijdens fixatie7. Van de vele technieken die beschikbaar zijn voor moleculaire analyse van FFPE-weefsels, is fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) effectief gebleken voor het visualiseren van specifieke DNA-sequenties8.
Ondanks de vooruitgang van moderne moleculaire diagnostische technieken, biedt het vermogen van FISH om genamplificatie op celniveau te visualiseren en te kwantificeren waardevolle inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorigenese en klinische resultaten. Door fluorescerend gelabelde sondes te gebruiken die complementair zijn aan het doelgen van belang, kan FISH gemakkelijk de lokalisatie van een oncogen oplossen en de vorm van oncogenamplificatie (zoals ecDNA) binnen individuele cellen afleiden, wat anders onmogelijk of duur is via andere technologieën. Daarom biedt FISH een economische manier om tumorheterogeniteit en klonale evolutie te beoordelen9. Bovendien heeft de vooruitgang op het gebied van automatisering, beeldvorming en computationele analyse high-throughput-analyse van FISH-gegevens mogelijk gemaakt, waardoor robuuste kwantificering van genamplificatie in grote weefselcohorten mogelijkis 10.
Het toepassen van FISH op FFPE-weefsel brengt echter inherente uitdagingen met zich mee, waaronder verknopingsartefacten en autofluorescentie op de achtergrond. Het overwinnen van deze obstakels vereist een zorgvuldige optimalisatie van elke procedure om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te garanderen. Dit artikel biedt een stapsgewijs, volledig geoptimaliseerd protocol voor het toepassen van FISH om genamplificatie in FFPE-weefselmonsters te onderzoeken. Met behulp van een sonde gericht op de ERBB2 (HER2) genlocus, tonen we aan dat FISH de ERBB2-amplificatiestatus robuust kan detecteren in FFPE-monsters van borstkankerpatiënten. Het is zelfs mogelijk om in te schatten of ERBB2 wordt geamplificeerd als ecDNA's. Door bestaande literatuur en onze experimentele bevindingen te synthetiseren, verhelderen we de methodologische overwegingen, technische uitdagingen en mogelijke valkuilen van op FISH gebaseerde analyse. We bespreken ook de klinische relevantie van genamplificatieprofilering bij verschillende soorten kanker, waarbij we de prognostische betekenis en het potentieel voor gepersonaliseerde therapeutische strategieën benadrukken.
Samenvattend onderstreept dit artikel het belang van FISH als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genamplificatie in FFPE-weefselmonsters, en biedt het ongeëvenaarde inzichten in tumorbiologie en begeleidt het de klinische besluitvorming in de oncologie. Met voortdurende verfijning en integratie met complementaire moleculaire assays, staat FISH-gebaseerde analyse klaar om ons begrip van de pathogenese van kanker verder te vergroten en de patiëntresultaten te verbeteren in het tijdperk van precisiegeneeskunde.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>Nucleuskleuring</td></tr><tr><td>Dextran sulfate 50% oplossing</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>Probe hybridisatie buffer</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) FISH Probe</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>FISH sonde</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Geweefdehydratie en -hydratatie</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>205821000</td><td>Probe hybridisatie buffer</td></tr><tr><td>Formula 83 (Xyleenvervanger)</td><td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>Paraffineverwijdering</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td>Staalbehandeling</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>Glijmiddelwassen</td></tr><tr><td>Pro-clean 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>Conserveermiddel voor SSC-buffer (optioneel)</td></tr><tr><td>Proteinase K (800 eenheden/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>Eiwitvertering</td></tr><tr><td>RNase A (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>Probe hybridisatie buffer</td></tr><tr><td>Slide Moat hybridisatiesysteem</td><td>Boekel Scientific</td><td>280001</td><td>Staal denaturering en hybridisatie. Alternatieve hotplates zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>S2713</td><td>SSC-buffer</td></tr><tr><td>Natriumcitraat dihydraat</td><td>Fisher BioReagents</td><td>FLBP3271</td><td>SSC-buffer en staalbehandeling</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2473500</td><td>Proteinase K verwerkingsbuffer</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td>Probe hybridisatie buffer</td></tr><tr><td>Vectashield antifade montagemedia</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H190010</td><td>Glijmiddelmontage</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>Autofluorescentiekwelkingskit</td></tr></tbody></table>

robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focale genamplificatie, zoals extrachromosomaal DNA (ecDNA), speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van kanker en therapieresistentie. Hoewel op sequencing gebaseerde methodologieën een onbevooroordeelde identificatie van ecDNA mogelijk maken, blijven cytogenetische technieken, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), tijd- en kosteneffectief voor het identificeren van ecDNA in klinische monsters. De toepassing van FISH in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters biedt een unieke weg voor het detecteren van geamplificeerde genen, vooral wanneer levensvatbare monsters niet beschikbaar zijn voor karyotype-onderzoek. Er is echter een gebrek aan consensusprocedures voor deze techniek. Dit protocol biedt uitgebreide, volledig geoptimaliseerde, stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van FISH om genamplificatie te detecteren, inclusief ecDNA, in FFPE-weefselmonsters die unieke uitdagingen met zich meebrengen die dit protocol wil overwinnen en standaardiseren. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers reproduceerbaar beeldvormingsgegevens van hoge kwaliteit verkrijgen om genamplificatie te beoordelen.

We gebruikten FFPE-monsters van zowel HER2-positieve als negatieve borstkankers om het resultaat van FISH-beeldvorming aan te tonen. Amplificatie van HER2 (gecodeerd door het ERBB2-gen ) is een gunstige marker vanwege de beschikbaarheid en effectiviteit van moleculaire targetingtherapieën voor HER2. Integendeel, patiënten met triple-negatieve borstkankers, die geen expressie van HER2, oestrogeenreceptor (ER) en progesteronreceptor (PR) missen, worden geconfronteerd met slechte resultaten vanwege beperkte therapeutische opties. Daarom is het bepalen van de HER2-status cruciaal in onderzoek naar en behandeling van borstkanker15.
In de triple-negatieve borstkankersteekproef vertonen de meeste kernen twee verschillende stippen die HER2/ERBB2 FISH-signalen vertegenwoordigen. Sommige kernen hebben mogelijk maar één stip als gevolg van doorsnedebias (Figuur 2, links). Daarentegen vertonen HER2-positieve monsters overvloedige FISH-signalen met twee verschillende patronen. Eén patroon toont verspreide stippen door de kern (Figuur 2, midden). Dit patroon is een kenmerk van de ecDNA-morfologie, aangezien ecDNA's mogelijk geen uniek en georganiseerd nucleair gebied bezetten16. Bovendien zorgt de asymmetrische segregatie van ecDNA's tijdens de mitose voor variatie in het aantal kopieën, wat leidt tot signaalheterogeniteit tussen kernen17. Sommige kernen kunnen af en toe clusters vertonen, wat wijst op ecDNA-hubs18 (Figuur 2, rechts). Het andere type HER2-versterking vertoont voornamelijk staafvormige, gecondenseerde aggregaten. Deze morfologie duidt waarschijnlijk op chromosoomgebaseerde amplificatie, zoals homogeen kleurende regio's (HSR)19 of via de breuk-fusie-brug (BFB) cyclus20. Met name ecDNA-, HSR- en BFB-amplificatie kunnen naast elkaar bestaan in dezelfde kern. Daarom wordt aanbevolen om meerdere kernen te onderzoeken om de vorm van focale amplificatie af te leiden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> Figuur 1: Schema voor FISH in FFPE-monsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> Figuur 2: Representatief FISH-beeld in FFPE-monsters van borstkanker. Vergroting: 600x; Schaalbalk: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol biedt een reproduceerbare methode om genamplificatie te visualiseren in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters.

Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.

ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is vaak vereist in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek voor selectie van therapie in gepersonaliseerde geneeskunde. Een nieuwe niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel-fixeerspray waarmee hoge kwaliteit morfologische, moleculaire en vis analyses van het zelfde model door toevoeging van een na fixatie stap voordat vis wordt aangeboden.

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer FISH-technieken voor robuuste detectie van genamplificatie in FFPE-weefselmonsters. Deze geoptimaliseerde methode verbetert datakwaliteit en biedt inzicht in kankerprogressie door oncogenamplificatie.

Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie (Video) | JoVE Journal

Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie

Meer video's verkennen