Name: Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer het ontwerp en de levering van tetracycline-gestuurde synthetische circuits voor Leishmania major-infectie. Deze methode onderzoekt parasieteliminatie en cytokine-expressie om gastheergerichte immunotherapieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de directeur van de Biotechnology Research and Innovation Council-National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS), Pune bedanken voor zijn steun aan ons onderzoek en de BRIC-NCCS Bioinformatics Facility.

Ontwerpen van tetracycline-gecontroleerde synthetische circuits voor leishmaniasis therapie

<ol><li>Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+Towards+a+better+understanding+the+mechanism+of+parasitic+infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity.</a> Front Immunol. 12, 661241(2021).</li>
<li>Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-metabolic+interactions+between+Leishmania+and+macrophage+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host.</a> Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).</li>
<li>Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+profile+of+human+macrophages+after+Leishmania+and+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection.</a> PloS one. 14 (12), e0225588(2019).</li>
<li>Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+From+systems+biology+to+improve+knowledge+of+Leishmania+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infection+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance.</a> Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
<li>Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+circuit+of+inositol+phosphorylceramide+synthase+in+Leishmania+a+chemical+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach.</a> J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+type+II+dehydrogenase+is+essential+for+parasite+viability+irrespective+of+the+presence+of+an+active+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
<li>Bolintineanu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+changes+in+tetracycline+repressor+binding+upon+mutations+in+the+tetracycline+operator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Eng+Data%22%5BJournal%5D)">Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator.</a> J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+buffering+gene+dosage+variation+between+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells.</a> Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).</li>
<li>Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+the+design+of+synthetic+gene+networks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells.</a> FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
<li>Renkema, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDHA+mutations+causing+a+multisystem+mitochondrial+disease%3A+novel+mutations+and+genetic+overlap+with+hereditary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Human+Gene%22%5BJournal%5D)">SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors.</a> Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+channelizing+protein-peptide+interactions+pipeline+for+host-parasite+paradigm+in+IL-10+and+IL-12+reciprocity+by+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
<li>Costello, A., Badran, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+circuits+within+an+orthogonal+central+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma.</a> Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).</li>
<li>Cooling, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+virtual+biological+parts%3A+a+repository+of+modular+modeling+components+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology.</a> Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+VW+%22The+effect+of+increasing+plasmid+size+on+transformation+efficiency+in+Escherichia+coli%22">The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli</a>. , (2002).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-dependent+metalloprotease+1+promotes+apoptosis+of+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages.</a> Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).</li>
<li>Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+adenovirus+infection%3A+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells.</a> J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).</li>
<li>Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+RAW264.7+cells+with+a+luciferase+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene.</a> J Vis Exp. (100), (2015).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).</li>
<li>Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+systems+for+doxycycline-inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression.</a> Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).</li>
<li>De Boeck, J., Verfaillie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inducible+overexpression+systems%3A+how+to+induce+your+gene+of+interest+without+inducing+misinterpretations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations.</a> Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methoxyl+Aesculetin+abrogates+lipopolysaccharide-induced+inflammation+by+suppressing+MAPK+and+AP-1+pathways+in+RAW+264.7+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells.</a> Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).</li>
<li>Tomiotto-Pellissier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+Leishmaniasis%3A+Broadening+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons.</a> Front Immunol. 9, 2529(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De verkregen resultaten onderstrepen de efficiëntie van de pijpleiding, die is gekanaliseerd voor het ontwerp en de implementatie van een synthetisch circuit. De bouw van dit synthetische circuit was een stap in de richting van de ontwikkeling van precisiegeneeskunde voor infectieziekten zoals leishmaniasis. Door middel van de in silico assemblage van genetische onderdelen en deterministische simulatie werd het onderscheidende modulerende effect van het TetON-systeem gemonitord. Het effect van de schakeling zou met name kunnen hebben geleid tot de wederzijdse bistabiele expressie van TetR en SDHA/GFP. De expressie van SDHA was periodiek, wat erop zou kunnen wijzen dat alleen in aanwezigheid van doxycycline de expressie ervan werd verhoogd. Om mogelijke veranderingen in expressiepatronen gedurende een periode waar te nemen, werd een tijdseenheid van 100 geselecteerd. Uit de resultaten blijkt dat het synthetische circuit periodiek gedrag vertoonde voor TetR en SDHA/GFP, waarschijnlijk toe te schrijven aan de orthogonale aard21. De assemblage van genetische onderdelen uit het iGEM-onderdelenregister speelde een cruciale rol, omdat het genetische componenten leverde die nodig waren voor het bouwen van synthetische circuits22. Modulaire rangschikking van genetische delen is essentieel, omdat de translatie en het functioneren van het circuit kunnen worden beïnvloed, wat kan leiden tot inefficiënte expressie en modulerend effect in cellen23.
De wisselplaatgrootte van het synthetische circuit was ongeveer 1,3 kb om ervoor te zorgen dat de grootte van de vector niet te groot is, wat de transformatie-efficiëntie mogelijk kan verminderen24. Het selecteren van een geschikte vector is een cruciale stap, omdat deze genetische delen moet bevatten, die essentieel zijn om het aantal kopieën in het bacteriële systeem te verhogen en een hoge plasmidekopie op te leveren, en de expressiemachinerie moet zich goed aanpassen aan het zoogdiersysteem25. De pEGFP-N1-vector is goed gekarakteriseerd in de RAW264.7-cellijn en bezit een compacte plasmidestructuur met een meervoudige kloonplaats26. In het laboratorium gestandaardiseerde bufferoplossingen werden gebruikt voor plasmide-isolatie om de productie van sterk geconcentreerd en zuiver plasmide te garanderen, dat werd gevalideerd door middel van spectrofotometrische schatting en AGE. De invoeging van het synthetische circuit in de pEGFP-N1-vector werd gevalideerd door middel van restrictievergisting en de monsters werden geanalyseerd op AGE en sequencing. De AGE-resultaten vertegenwoordigden een 1,3 kb-band van insert, 4,7 kb-band van pEGFP-N1-vector en 6 kb-band van het gehele synthetische circuit. 
Transfectie met behulp van 1:1, 1:2 en 2:1 verhouding van DNA: PEI-verhoudingen werd uitgevoerd, waarbij de waargenomen verhouding van 1:1 het beste werkte zonder de celmorfologie te verstoren (gegevens niet getoond). Het wordt aanbevolen om een concentratie van 400 μg/ml - 1000 μg/ml G418 te gebruiken voor de selectie van getransfecteerde cellen27. Een 500 μg/ml G418 werd gebruikt voor de selectie van getransfecteerde cellen, omdat het de groei van niet-getransfecteerde cellen effectief onderdrukte zonder de celgroei of morfologie van getransfecteerde cellen in gevaar te brengen (gegevens niet getoond). Gezien het belang van het celfenotype voor de transfectie-efficiëntie, met name in macrofaagcellijnen, die differentiatie kunnen ondergaan en moeilijk te transfecteren kunnen worden, werd een laag passagegetal van de RAW264.7-cellijn gebruikt voor transformatie28. Het aantal celpassages kan ook een kritische factor zijn in de efficiëntie van transfectie. Een hoog passagegetal kan leiden tot inefficiënte transfectie29. Dox is de voorkeursinductor voor het Tet-ON-inductiesysteem vanwege de hoge bindingsefficiëntie aan TetR, gunstige weefselverdeling, lage toxiciteit en een halfwaardetijd van 24 uur30. Na transfectie werden cellen gedurende 24 uur geïnduceerd met dox en werden ze geobserveerd op GFP-expressie. Voor RAW264.7-cellen was de concentratie dox die werd gebruikt voor inductie van synthetische circuits 1 μg/ml, wat in het aanbevolen bereik van 1-2 μg/ml31 valt (gegevens niet weergegeven). De regulatie van de SDHA-concentratie na inductie was echter onbepaald. Over het algemeen zijn de bepaling en standaardisatie van het aantal celpassages, DNA: PEI-concentratie, concentratie van transfectieselectiemarkers van zoogdieren en doxycycline-inductieconcentratie cruciale factoren in het transfectieproces.
Na de inductie van het synthetische circuit na infectie op verschillende tijdstippen, werd een significante vermindering van de intracellulaire parasietbelasting waargenomen. Een vergelijking van de parasietbelasting tussen geïnfecteerde en IMTI-monsters onthulde een lagere belasting in cellen geïnduceerd met het synthetische circuit, waarschijnlijk toe te schrijven aan SDHA-expressie. Aangezien SDHA-expressie geassocieerd is met NO-productie, werd waargenomen dat IMTI-cellen een onregelmatige en ruwe morfologische vorm hebben, die optreedt in de RAW264.7-cellijn wanneer NO wordt geproduceerd32. IL-10- en IL-12-niveaus na infectie van 6 uur waren het hoogst, aangezien is gemeld dat beide cytokinen op dit tijdstip worden opgereguleerd, die verder fenotypische modificatie ondergaan om IL-10 meer te produceren danIL-12 19. Aangezien IL-10- en IL-12-niveaus de post-transfectie en in IMTI-monsters niet significant veranderden, werd cytokineprofilering uitgevoerd om pro-inflammatoire en ontstekingsremmende cytokineresponsen te detecteren. 
Expressieniveaus van TNF-α, IFN-γ en TGF-β werden geïdentificeerd in 6 uur infectie, IMT en 24 uur IMTI-monsters. Om intracellulaire parasieten te elimineren, zijn TNF-α en IFN-γ voornamelijk essentieel omdat ze oxidatieve uitbarstingen induceren door NO-productie. M2 gepolariseerde macrofagen brengen TGF-β tot expressie, wat pro-inflammatoire cytokines naar beneden reguleert33. Het 24-uurs IMTI-monster vertoonde een verhoogde TNF-α- en IFN-γ-expressie dan TGF-β, wat suggereert dat de macrofagen, bij transfectie en infectie met L. major, mogelijk gepolariseerd zijn tot pro-inflammatoir cytokine dat fenotype tot expressie brengt. De studie geeft daarom inzicht in de fenotypische veranderingen die worden veroorzaakt door transfectie met een synthetisch circuit en benadrukt de infectiedynamiek. Het effect van de synthetische circuits als therapeutisch middel kan worden onderzocht, aangezien hun inductie de pro-inflammatoire cytokine-expressie aanzienlijk had verhoogd in vergelijking met ontstekingsremmend cytokine. De studie vestigde dus niet alleen de constructie en toedieningspijplijn van het synthetische circuit, maar toonde ook het therapeutisch potentieel ervan aan in een leishmaniasis-model door de opregulatie van pro-inflammatoire cytokines in door Leishmania uitgedaagde gastheercellen.

De vooruitgang van holistische, integratieve geneeskunde is een belangrijk verband dat is geïdentificeerd tussen metabole veranderingen in immuuncellen en hun vermogen om het fenotype van immuuncellen bij infectieziekten te moduleren. Immunometabolisme biedt nieuwe perspectieven voor het ophelderen van de pathogenese van veel voorkomende infectieziekten bij mensen. Bovendien biedt het veelbelovende technieken voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen door nieuwe aangrijpingspunten voor interventiete identificeren 1. Metabole herprogrammering van immuuncellen wordt geïdentificeerd bij verschillende infectieziekten, waaronder leishmaniasis. Leishmania spp. is verantwoordelijk voor het veroorzaken van leishmaniasis, waarvan Leishmania major (L. major) cutane leishmaniasis (CL) veroorzaakt. L. belangrijke parasieten hebben een aanzienlijke invloed op het metabolisme van gastheercellen, met name in macrofagen, voor proliferatie en overleving als intracellulaire parasieten2. Macrofagen kunnen doorgaans polariseren in klassiek geactiveerde (M1) of alternatief geactiveerde (M2) subsets waarbij M1-cellen een hoge pro-inflammatoire cytokinesecretie en productie van stikstofmonoxide (NO) bezitten via het metabolisme van stikstofsoorten. M2-cellen vertonen verhoogde niveaus van ontstekingsremmende cytokines en vertonen een hoge arginase-activiteit door het stikstofmetabolisme3. Beide fenotypes verschillen dus niet alleen door hun immuunrespons, maar ook door hun metabole routes.
Systeembiologie van leishmaniasis heeft tot doel moleculaire doelen te identificeren voor het ontwerpen van nieuwe therapieën door middel van het ontwerpen en ontwikkelen van geneesmiddelen. Reconstructie van signaleringsnetwerken en metabole routes helpt bij het begrijpen van leishmaniasis als een holistisch model en trekt inzicht voor de identificatie van de belangrijkste component die de zieke toestand veroorzaakt. Wiskundige modellering is een van de meest favoriete toegepaste analytische benaderingen voor het begrijpen van de complexiteit van leishmaniasis4. Immunometabole netwerken en wiskundige modellen maakten de identificatie van succinaatdehydrogenase (SDHA) mogelijk als een sleutelcomponent van het M1-fenotype, dat tot expressie wordt gebracht om de parasiet te elimineren5. Synthetische biologie heeft toepassingen in diagnostiek, vaccinontwikkeling en therapieën bij leishmaniasis. Metabolisme gericht op modulatie van de immuunrespons kan worden bereikt door middel van synthetische biologie-instrumenten. Voor modulatie van inositolfosforylceramidesynthase dat het sfingolipidenmetabolisme reguleert en de immuunsignalering van de gastheer verandert, werd een genetisch circuit met bistabiel gedrag gebruikt om de intrinsieke robuustheid van L. major infectiemodel 6,7 synthetisch af te stemmen. Daarom kunnen systemen en synthetische biologie een modelgebaseerd platform voor genetische manipulatie bieden voor de ontwikkeling van precisiegeneeskunde in het Leishmania-modelsysteem.
Het M1-fenotype wordt gekenmerkt door de expressie van immunometabole signaleringsnetwerken waarbij de productie van inflammatoire cytokines en metabole routes synergetisch de eliminatie van parasieten verbetert. M1-polarisatie betekent de productie van pro-inflammatoire cytokines zoals interleukine-12 (IL-12), interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α). Metabole routes die sterk verrijkt zijn in het M1-fenotype zijn onder meer glycolyse, pentosefosfaatroute en afgeknotte tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus)5. De afgekapte TCA-cyclus stuurt de eliminatiemachine van parasieten door middel van verhoogde succinaat- en citraatgehalten, die de productie van NO3 sturen. Accumulatie van succinaat door SDHA leidt tot activering van transcriptiefactor hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α), die de productie van IL-1β8 induceert. In het M2-fenotype worden vetzuuroxidatie, toename van het glutaminegebruik en verbeterde oxidatieve fosforylering van glucose waargenomen, samen met de productie van ontstekingsremmende cytokines zoals interleukine-10 (IL-10), transformerende groeifactor bèta (TGF-β), interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13)3. M2 vertoont langwerpige mitochondriën als een onderscheidend kenmerk, wat leidt tot een verbeterde efficiëntie bij het opwekken van energie. Ze gebruiken vetzuren, glucose en glutamine als substraten om de TCA-cyclus van brandstof te voorzien, waardoor ATP wordt gegenereerd door oxidatieve fosforylering met een hogere snelheid om de groei en proliferatie van parasieten te bevorderen. Het SDHA-enzym dat verantwoordelijk is voor de accumulatie van succinaat door afgekapte TCA kan niet alleen de NO-productie bevorderen, maar ook een succinaat-afhankelijk zuurstofverbruik op gang brengen via elektronentransport10. Bij met Leishmania geïnfecteerde macrofagen wordt SDHA 2,17 keer gedownreguleerd, wat aangeeft dat de aerobe ademhaling ook gedownreguleerd kan zijn11. Om de consumptie van succinaat te verhogen om pro-inflammatoire cytokine-gemedieerde NO-productie te induceren en de eliminatie van parasieten te bevorderen, is expressie van SDHA essentieel.
Het synthetische circuit biedt precisiegerichte therapieën die het zieke systeem kunnen veranderen om een bistabiele oscillatie te bereiken die een gezond fenotype op spatiotemporeel niveau kan herstellen. De levering en expressie van synthetische circuits maken het systeem dynamisch en robuust. Een cruciale factor die bijdraagt aan de vooruitgang van synthetische biologie ligt in het vermogen om genetische onderdelen en elementen op een modulaire manier te assembleren om het genereren van ingewikkelde architecturen en op maat gemaakte functionaliteiten mogelijk te maken12. Beperkingen in verband met traditionele expressietechnieken hebben geleid tot de opkomst van op tetracycline operon gebaseerde induceerbare plasmide synthetische circuits, waardoor een snelle evaluatie van plasmide en gemakkelijke afgifte over verschillende celtypen mogelijkis13. Het tetracycline-responsieve repressor (TetR) eiwit, wanneer het bestaat als een dimeer, vertoont een sterke bindingsaffiniteit met het tet-operon (TetO), waardoor transcriptie effectief wordt onderdrukt. Bij de interactie van zijn ligand, doxycycline (dox), ondergaat TetR echter een structurele verandering, wat resulteert in zijn dissociatie van TetO, waardoor de transcriptie ongehinderd kan doorgaan. Dit circuit kan controle over de eiwittranslatie vertonen14. Daarom werd door de gedefinieerde methodologie het ontworpen tetracycline-operon-gebaseerde induceerbare plasmide synthetisch circuit in staat gesteld SDHA tot expressie te brengen in de pEGFP-N1-vector. Evaluatie van de transformatie-efficiëntie van het circuit en de opbrengst ervan gaf inzicht in de competentie van levering. Door de vergisting van de vector te beperken, werd de bepaling van de kloneringsefficiëntie bevestigd. Verder werd een getransfecteerde RAW264.7 muismacrofaagcellijn afgeleid van peritoneale macrofagen van Balb/c-muizen waargenomen voor doxycycline-dosisafhankelijke expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in getransfecteerde cellen. Bovendien werd het eliminatie-effect van parasieten in getransfecteerde cellen bevestigd door een expressie van het synthetische circuit. Bovendien werden inductie en expressie van pro-inflammatoire cytokines waargenomen, wat werd gestuurd door een toename van het tijdstip van infectie in de synthetische circuit getransfecteerde en geïnduceerde cellen, wat direct verband hield met de werking van het synthetische circuit.

<table><tbody><tr><td>10 &mu;L tips</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X restriction buffer</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Restrictie digestie</td></tr><tr><td>1mL tips</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL tube</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L tips</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenylindool</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>nucleaire kleuring</td></tr><tr><td>50mL tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm platen</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Cyan/Orange Loading buffer</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Belasting monsters voor AGE</td></tr><tr><td>96 wel dekglas bodemplaat</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Voor confocale beeldvorming en transfectie</td></tr><tr><td>96 wel microtestplaat met platte bodem</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Voor AGE</td></tr><tr><td>Agarose gelelektroforese opstelling</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>Voor AGE</td></tr><tr><td>Bacterieel laminair stromingsveld</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Voor transformatie</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Buffer /Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Cell cultuur laminair luchtstroom</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Celkrabber</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Celverspreider</td><td>Fischer Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor 1.5mL buizen</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor 50mL valk</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chloorform</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>Voor RNA-isolatie</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Cuvet</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>Schatting van plasmideconcentratie</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 gel imager</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Voor AGE</td></tr><tr><td>DEPC BEHANDELD H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Voor RNA-isolatie</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Voor inductie van getransfecteerde cellen</td></tr><tr><td>Droge verwarmingsblok</td><td>Labnet</td><td></td><td>Voor transformatie en inactivatie van restrictie-enzymen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Aangepast Eagle Medium</td><td>Nationaal centrum voor celwetenschap</td><td></td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Buffer /Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Voor AGE</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Buffer /Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Evos brightfield microscoop</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td>voor constructie van synthetische kring</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>FV31S-SW software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>Geneticine</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>voor transfectie</td></tr><tr><td>Gibson-assemblagemethode voor klonering</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Constructie van synthetische kring</td></tr><tr><td>Graphpad prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Statistische analyse</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>voor cDNA-synthese</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Buffer /Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Voor transformatie en kolonieselectie</td></tr><tr><td>Luria Bertini bouillon</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Voor het kweken van E.coli</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Buffer /Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Micro Filt Vertical Laminar Air Flow</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>Voor qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>Voor qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>Voor AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probes</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probes</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman probes</td></tr><tr><td>Muis ELISA Kit IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>Voor ELISA</td></tr><tr><td>Muis ELISA Kit IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>Voor ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky met touchscreen + &mu;Drop Plate</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>Voor ELISA</td></tr><tr><td>MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Aanpasbare 0-1500 rpm Laboratorium Shaker Agitator</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nationaal centrum voor biotechnologie-informatie</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>voor constructie van synthetische kring</td></tr><tr><td>Neubauer's kamer</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Voor celtelling</td></tr><tr><td>Niet-geventileerde 25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Voor het kweken van parasiet</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Restrictienezym</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Reagens voorbereiding</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>OPTI-MEM media</td><td>Gibco</td><td>319

immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Immunometabolisme is een cruciale bepalende factor in de progressie van leishmaniasis. Op synthetische biologie gebaseerde benadering heeft veel aandacht gekregen als een stap in de richting van therapeutische interventie gericht op gastheer-geassocieerde factoren die leishmaniasis veroorzaken. Synthetische biologie omvat de engineering van genetische componenten op een orthogonale en modulaire manier om biologische systemen nauwkeurig te moduleren, waardoor cellen nieuwe functies krijgen. In de gepresenteerde studie was de opheldering van een systematische pijplijn voor de ontwikkeling van een induceerbaar tetracycline-gecontroleerd (TetON) gebaseerd synthetisch circuit gericht op het leveren van succinaatdehydrogenase als therapeutisch middel om de eliminatie van intracellulaire Leishmania-parasieten te vergemakkelijken. Het geschetste protocol beschrijft het ontwerpen van een synthetisch circuit en de daaropvolgende validatie ervan. De voorgestelde strategie concentreert zich ook op de integratie van synthetische circuits in de plasmide-ruggengraat als leveringsvoertuig. Bovendien werden toedieningsmachines met behulp van op polyplexen gebaseerde nanodeeltjes voor de levering van synthetische circuits gebruikt in muizen macrofaagcellijnen zonder de cellulaire morfologie in gevaar te brengen. Standaardisatie van de methode werd uitgevoerd voor het selecteren van getransfecteerde cellen en het bepalen van de optimale inductieconcentratie voor expressie van synthetische circuits. Waarnemingen onthullen een duidelijke vermindering van de intracellulaire parasietbelasting in getransfecteerde cellen in vergelijking met geïnfecteerde cellen. Pro-inflammatoire cytokinen werden na infectie tot expressie gebracht in synthetisch circuit getransfecteerde en geïnduceerde cellen als een mechanisme om de eliminatie van parasieten te bevorderen. Dit onderstreept de op synthetische biologie gebaseerde methode als een krachtige benadering bij leishmaniasis door zich te richten op gastheerfactoren die verband houden met ziekteprogressie.

De rangschikking van genetische delen die het synthetische circuit vormen voor het tot expressie brengen van het synthetische circuit wordt weergegeven in (Figuur 1A). De overeenkomstige delen werden gekloond in de pEGFP-N1-vector op een orthogonale en modulaire manier, die wordt weergegeven in figuur 1B. De simulatie van het synthetische circuit onthulde oscillerende dynamica in zowel SDHA als de tetracycline-repressor. Deze waarneming suggereert een wederkerig expressiepatroon dat wordt gekenmerkt door periodieke golffuncties. De toename van de SDHA-concentratie kan worden toegeschreven aan de inductie van doxycycline, terwijl de expressie van TetR het gevolg kan zijn van dalende niveaus van doxycycline (Figuur 1C). Gezien de induceerbare oscillerende expressie van SDHA en TetR waargenomen in silico, werd een strategie voor de levering van synthetische circuits via pEGFP-N1-plasmidevector ontworpen en geïmplementeerd.
De iGEM-onderdelen die voor het onderzoek zijn geïdentificeerd, omvatten respectievelijk BBa_K1493803 voor TetO, BBa_K4344028 voor de Kozak-sequentie, BBa_C0040 voor TetR en BBa_K1537016 voor P2A. De NCBI-toetredings-ID voor SDHA is NM_025848. Deze componenten werden geassembleerd om een doxycycline-induceerbaar TetON synthetisch circuit te construeren, dat in totaal 1317 basenparen omvat (aanvullend bestand 1). Omdat TetO functioneert als een DNA-regulerend element, werd de sequentie ervan niet vertaald. Voor in silico validatie van de vertaling werd gekozen voor sequentie stroomafwaarts van de Kozak-sequentie, die zich uitstrekt van 5' TetR tot het 3'-uiteinde van P2A, stroomafwaarts van SDHA. Observatie toonde de afwezigheid van interne stopcodons aan, wat een ononderbroken translatie over de gehele sequentielengte garandeert (aanvullend bestand 2). De regulerende delen van een synthetisch circuit bestaande uit 1317 bp werden ingevoegd tussen NotI- en XhoI-restrictieplaatsen, die 5' stroomopwaarts van EGFP liggen (figuur 1B). Sequentieresultaten benadrukken dat de insert-sequentie is gekloond in het plasmide (aanvullend bestand 3).
De introductie van een immuno-metabool circuit in de E. coli DH5α-stam leidde tot de groei van getransformeerde kolonies die resistent waren tegen kanamycine, het antibioticum dat wordt gebruikt als selectieve marker tijdens bacteriële transformatie. De overvloedige aanwezigheid van getransformeerde kolonies op de selectieplaat was hoger, wat suggereert dat de competente cellen een hoog transformatiepotentieel vertoonden, wat een indicatie is van de efficiëntie van het gebruikte transformatieprotocol (Figuur 1D).
Een enkele kolonie werd geïsoleerd en gezaaid in 10 ml LB aangevuld met kanamycine voor isolatie van plasmide. De plasmideopbrengst afkomstig van een cultuur van 10 ml wordt gedetailleerd beschreven in tabel 1. Voor deze procedure werd een standaardmethode voor plasmide-isolatie gebruikt. Bufferoplossingen werden de dag voorafgaand aan de plasmide-isolatie vers bereid en de incubatieomstandigheden werden geoptimaliseerd om de plasmideopbrengst te maximaliseren. De verkregen plasmideconcentratie bedroeg meer dan 1 μg/μL, met 260/280 en 260/230 verhoudingen die respectievelijk 1,8 en 2,0 overtroffen. Deze bevindingen geven aan dat de geïsoleerde plasmiden van hoge zuiverheid waren en vrij van verontreinigingen zoals eiwitten, EDTA, koolhydraten en fenol.
De elektroforetische mobiliteitsverschuiving voor het geïsoleerde synthetische circuit werd geëvalueerd. Restrictievergisting werd uitgevoerd met behulp van NotI- en XhoI-restrictie-enzymen, omdat dat de restrictieplaatsen waren waar het synthetische circuit werd ingebracht. Er werden twee banden waargenomen op 1% agarosegel, één band in de buurt van 1500 bp en één tussen 4 kb en 5 kb. Aangezien de grootte van de insert 1317 bp is, komt de band bij 1500 bp waarschijnlijk overeen met de insert. De pEGFP-N1 vector heeft een grootte van 4,7 kb. Daarom wordt aangenomen dat de band in de buurt van 5 kb de pEGFP-N1-vector is. Bijgevolg werd geconcludeerd dat er een volledig en intact synthetisch circuit aanwezig was binnen de afgiftevector. Bovendien werd een band van ongeveer 6 kb gedetecteerd voor het onverteerde intacte synthetische circuit, wat aangeeft dat de pEGFP-N1-vector een insert van bijna 1,3 kb in de plasmidevector herbergt (Figuur 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Figuur 1: Ontwerp en validatie van synthetische circuits. (A) Weergave van synthetische circuits door de assemblage van genetische onderdelen en regulerende componenten. (B) Deterministische simulatiegrafiek die de periodieke expressie van SDHA en TetR toont in eenheden van 100 tijd. (C) Getransformeerde kolonies van E. coli DH5α resistent tegen kanamycine. De eenheid is een eenheid van 100 keer omdat het een deterministische simulatie is. (D) Agarosegelelektroforese van intact en restrictief verteerd synthetisch circuit met behulp van NotI- en XhoI-restrictie-enzymen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentratie van plasmide (μg/ml)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Opbrengst van het synthetisch circuitconstruct verkregen na plasmide-isolatie. De tabel toont de concentratie van plasmide in μg/ml, hun verhouding van 260/280 en 260/230.
In de controle- en geïnfecteerde cellen was de waargenomen fluorescentie-intensiteit laag voor GFP. Er werd echter waargenomen dat transfectie van het synthetische circuit met een verhouding van 1:1 van plasmide en PEI met 500 μg/ml G418 en inductie met 1 μg/μL dox een hoge GFP-expressie in IMT-cellen induceerde. In 6 uur IMTI-cellen was de GFP-expressie ook significant hoger, hoewel de GFP-expressie lager was dan in de IMT-steekproef (Figuur 2A,B). Verder werd een toename van de GFP-expressie waargenomen in 12 uur IMTI, 18 uur IMTI en 24 uur IMTI-monsters. Deze toename kan te wijten zijn aan een toename van de tijd van infectie, wat mogelijk hogere metabole veranderingen in macrofagen heeft veroorzaakt door residentiële parasiet17. Intracellulaire SDHA-spiegels kunnen worden beïnvloed door een toename van de infectietijd18. Aangezien dox aan deze IMTI-monsters werd toegevoegd, kunnen de SDHA-niveaus via synthetische circuits zijn toegenomen, wat heeft geleid tot een toename van de expressie van SDHA.
DAPI-kleuring werd gedaan om het aantal residentiële parasieten in de macrofagen te identificeren. In 6 uur L. major geïnfecteerde macrofagen was het waargenomen aantal intracellulaire parasieten 6 cellen per macrofaag, wat hoger is in vergelijking met het 6 uur durende IMTI-monster, dat 1-2 intracellulaire parasieten per macrofaag had. Na transfectie en dox-inductie werd een significante vermindering van de intracellulaire parasietbelasting waargenomen op verschillende tijdstippen van infectie (Figuur 2C). Waarnemingen suggereerden dat synthetische circuits mogelijk parasiet-eliminerende effecten hebben veroorzaakt door SDHA-expressie te stimuleren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Figuur 2: Confocale laserscanmicroscopie. Afbeeldingen van controle-, geïnfecteerde, IMT- en IMTI-monsters. (A) Expressieanalyse van GFP in alle experimentele monsters met een schaalbalk van 50 μm voor controle, 6 uur geïnfecteerd en IMT, 20 μm voor 6 uur IMTI, 10 μm voor 12 uur IMTI, 18 uur IMTI en 24 uur IMTI. De gebruikte kanalen waren DIC, DAPI, GFP en samengevoegde afbeeldingen van alle kanalen. (B) One-way ANOVA met Tukey's correctietest van alle experimentele monsters (n=3) voor GFP-expressie (p < 0,05 wordt als significant beschouwd) Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. (C) One-way ANOVA met Tukey's correctietestanalyse van de parasietbelasting in 100 macrofaagcellen voor monsters van (A) (n=3) werd uitgevoerd (p < 0,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Detectie van IL-10- en IL-12-niveaus in de media van alle monsters onthulde dat de concentratie van IL-10 en IL-12 het hoogst was 6 uur na infectie met neerwaartse regulatie van cytokineniveaus na 24 uur infectie. Er was geen significant verschil in IL-10 en IL-12 niveaus bij transfectie en inductie van synthetische circuits. Ook was er een niet-significant verschil in IL-10- en IL-12-niveaus in IMTI-tijdpuntmonsters (Figuur 3). Er is al gemeld dat het 6 uur geïnfecteerde monster expressie van IL-10 en IL-1219,20 vertoont, het waarnemen van een niet-significant verschil in IL-10 en IL-12 zorgde ervoor dat we het effect van het synthetische circuit op andere cytokines onderzochten.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Figuur 3: ELISA van IL-10 en IL-12 om hun secretoire niveaus in media van verschillende monsters te identificeren. Monsters (n=2) omvatten controle, 6 uur geïnfecteerd, 24 uur geïnfecteerd, IMT, 6 uur IMTI, 12 uur IMTI, 18 uur IMTI, 24 uur IMTI. Tweezijdige ANOVA met Tukey's correctietestanalyse werd uitgevoerd (p <,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Detectie van transcriptieniveaus van TNF-α, IFN-γ en TGF-β in 6 uur geïnfecteerde, IMT- en 24-uurs IMTI-monsters onthulde dat een significante toename van TNF-α tot 2,5-voudig werd waargenomen in 24-uurs IMTI-monsters in vergelijking met infectie- en IMT-monsters (Figuur 4). In de 24-uurs IMTI-steekproef werd een 35-voudige toename van de IFN-γ-niveaus waargenomen in vergelijking met infectie- en IMT-monsters. TGF-β niveaus, hoewel ze een significante opregulatie vertoonden tot 1,5-voudig in de 24-uurs IMTI-steekproef, was de relatieve vouwverandering lager in vergelijking met TNF-α en IFN-γ, wat suggereert dat pro-inflammatoire cytokines significant worden opgereguleerd in de 24-uurs IMTI-steekproef.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Figuur 4: qRT-PCR-analyse van cytokines. (A) TNF-α, (B) IFN-γ en (C) TGF-β gedurende 6 uur geïnfecteerde, IMT- en 24-uurs IMTI-monsters (n=2). Er werd eenrichtings-ANOVA uitgevoerd met de correctietest van Tukey (p < 0,05 wordt als significant beschouwd). Foutbalken geven de standaarddeviatie weer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: Nucleotidesequentie van genetische onderdelen die zijn geassembleerd om het synthetische circuit te vormen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Vertaalde sequentie van synthetische schakelingen die TetR, P2A en SDHA tot expressie brengen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 3: Sequentieresultaat van het gekloonde synthetische circuit in pEGFP-N1 plasmide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Monocyten zijn integrale componenten van het menselijke aangeboren immuunsysteem die afhankelijk zijn van glycolytisch metabolisme wanneer geactiveerd. We beschrijven een flowcytometrieprotocol om glucosetransporterexpressie en glucoseopname door totale monocyten en monocytensubpopulaties in vers volbloed te meten.

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.

Experimentele infectie met<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als een model voor de studie Host Interferon-γ Responses

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.

Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Op volbloed gebaseerde immunoassays bieden een gemakkelijk en hulpbronnenefficiënt hulpmiddel om antigeenspecifieke immuniteit te analyseren voor diagnostische en onderzoeksdoeleinden. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd volbloedprotocol met dubbele co-stimulatie voor uitgebreide analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen, inclusief een versie met een laag volume voor pediatrische patiënten en kleine dieren.

Volbloedtest met dubbele co-stimulatie voor antigeenspecifieke analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Het huidige protocol beschrijft een experimentele workflow die de ex vivo analyse van menselijke T-celstimulatie mogelijk maakt in een allogene...

Analyse van menselijke T-celactiviteit in een allogene co-cultuursetting van voorbehandelde tumorcellen

Dit artikel schetst een veelzijdige methode om uit de cel afkomstige weefsel ringen te creëren door cellulaire zelf-assemblage. Gladde spiercellen gezaaid in de ring-vormige agarose putten aggregaat en contract tot robuuste driedimensionale (3D) weefsels maken binnen de 7 dagen. Millimeter schaal weefsel ringen bevorderlijk zijn voor mechanische testen en dienen als bouwstenen voor weefsel montage.

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Leer het ontwerp en de levering van tetracycline-gestuurde synthetische circuits voor Leishmania major-infectie. Deze methode onderzoekt parasieteliminatie en cytokine-expressie om gastheergerichte immunotherapieën te ontwikkelen.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Meer video's verkennen