Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Systeembiologie biedt inzicht in de biologische netwerken en mechanismen in infectiemodellen, terwijl synthetische biologie precisietherapie mogelijk maakt. We onderzoeken het immunometabolisme bij een grote Leishmania-infectie en het potentieel van biosynthetische circuits voor het oplossen van ziekten, wat een revolutie teweegbrengt in immunotherapeutica. In de afgelopen jaren is synthetische biologie veelbelovend gebleken voor de ontwikkeling van nieuwere en effectieve strategieën om Leishmaniasis te bestrijden.

Enkele van de recente ontwikkelingen liggen op het gebied van technische synthetische cytokines, bistabiel synthetisch circuit CRISPR-Cas9 en synthetische peptiden worden onderzocht als therapieën. Ons protocol richt zich op het gastheereiwit, dat door de parasiet wordt gemoduleerd voor zijn overleving. Zo bestuderen we het effect op het circuit, niet alleen op de parasiet, maar ook op de gastheer.

Bovendien hebben we het effect van synthetische schakelingen bestudeerd op het aanpakken van orthogonaliteit en modulariteitsfunctie bij levering in de gastheer. Open om te beginnen op een computer de TinkerCell-software en klik op het tabblad onderdelen. Selecteer de CMV-promotorcomponent uit de bibliotheek en plaats deze op het canvas om de cytomegaloviruspromotor binnen het synthetische circuit te symboliseren.

Haal vervolgens de repressorbindingsplaats op die analoog is aan de tetracycline-operator en plaats deze naast de promotor op het canvas, integrerend met de CMV-promotor. Sleep de interne ribosoomingangsplaatsen en het coderende gebied naar het canvas en integreer ze met de bestaande genetische componenten. Wijzig de naam van het coderende gebied in tetracycline-responsieve repressor.

Voeg deze genetische elementen samen om de constructie van de synthetische onderdelen te vergemakkelijken. Breng een afstandsgebied dat kan worden gesplitst door varkensteschovirus 12A op het canvas aan. Introduceer een extra coderend gebied, succinaatdehydrogenase of SDHA, dat het gen vertegenwoordigt dat van belang is in het synthetische construct en het integreert met de andere elementen.

Integreer naast het SDHA-coderingsgebied een ander afstandsgebied dat kan worden gesplitst door cellulair protease varkensteschovirus 12A. Introduceer een coderend gebied dat het reporter-gen vertegenwoordigt en label het als GFP in het construct. Voeg naast GFP een terminator toe.

Om de vorming van een functioneel genetisch circuit te verifiëren, klikt u op een deel van het circuit. Het circuit verschijnt rood bij het klikken. Wijs op het tabblad Reactie regulerende snelheden toe aan tetracycline-responsieve repressor, SDHA en GFP om de translatiereactie binnen het synthetische circuit af te bakenen.

Voeg een klein molecuul toe van het tabblad onderdelen en noem het doxycycline. Om een golffunctie aan doxycycline toe te wijzen, selecteert u op het tabblad onderdelen en verbinding invoer invoer en klikt u op golfinvoer. Klik op het tabblad reactie op repressiereactie.

Sleep de reactiesnelheid op het canvas tussen dox en tetracycline-responsieve repressor. Om de reactiekinetiek tussen dox en tetracycline-responsieve repressor in te stellen, dubbelklikt u op het golffunctiepictogram op dox en past u doxycycline.sin aan. amplitude tot 10.

Om de transcriptionele regulerende reactie tussen het tetracycline-responsieve repressoreiwit en de repressorbindingsplaats te implementeren, selecteert u de reactie op het reactietabblad en plaatst u deze op het canvas tussen de tetracycline-responsieve repressor en tetracycline-operator. Dubbelklik op elk onderdeel en elke reactie om een initiële concentratie en parameter voor simulatie in te stellen. Klik op simulatie, kies deterministisch en simuleer het circuit voor 100 tijdseenheden.

Pas de simulatiegrafiek aan vanaf het bedieningspaneel en observeer het grafiekpatroon voor SDHA en tetracycline-responsieve repressieve eiwitten. Open het register met standaard biologische onderdelen, klik vervolgens op zoeken en voer de naam van de genetische component in. Om de nucleotidesequentie van de CMV-promotor te verkrijgen, klikt u op de volgorde van het ophalen van onderdelen en slaat u het bestand op als een tekstbestand.

Om de eiwitcoderende sequentie van SDHA te verkrijgen, opent u NCBI en kiest u nucleotide in de vervolgkeuzelijst naast het zoekvenster. Typ succinaatdehydrogenase en Mus musculus en zoek naar nucleotidesequentie. Klik op de CDS-optie om de coderingsvolgorde van SDHA op te halen en de reeks op te slaan in een tekstbestand.

Voeg achtereenvolgens de nucleotidesequentie van alle genetische regulerende onderdelen samen in één bestand. Voeg direct na de Kozak-sequentie een startcodon ATG toe en verwijder de interne stopcodons om de vorming van ontluikende polypeptiden te voorkomen. Open de Expasy-website en plak de nucleotidesequentie.

Klik op de optie voor het vertalen van de sequentie, selecteer vervolgens vijf prime three prime frame één en verwijder de stopcodons. Kweek om te beginnen RAW264.7-cellen bij 37 graden Celsius totdat 90%confluentie is bereikt. Bereid de volgende monsters voor om het parasieteliminerende effect van het geïnduceerde synthetische circuit te bepalen.

Schraap de RAW264.7-cellen uit een kolf van 25 vierkante centimeter. Centrifugeer de celsuspensie bij 300G gedurende vijf minuten en suspendeer de pellet opnieuw in één milliliter DMEM compleet medium. Breng 10 microliter van de opnieuw gesuspendeerde celsuspensie over in een buis van 100 microliter.

Voeg 10 microliter 0,5% trypan blauw toe aan de cellen en meng goed. Laad 10 microliter cel- en trypan blue-mix op het glaasje van de celtelkamer en neem het celgetal uit vier kamers. Plaat twee keer 10 tot de macht vier cellen per putje in het deksel, schuif de bodem van 96-wells plaat en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Om een zes uur geïnfecteerd monster voor te bereiden, centrifugeert u één milliliter stationaire fase Leishmania major promastigoten bij 7, 273G gedurende 10 minuten en suspendeert u de pellet opnieuw in 500 microliter DMEM compleet medium. Voeg na het tellen twee keer 10 toe aan de macht van vijf L.major promastigoten in de bodemplaat met 96 putjes aan de dekplaat. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende zes uur.

Was de cellen na de incubatie drie keer met PBS. Om de IMT- en IMTI-monsters voor te bereiden, kweekt u twee keer 10 tot de macht van vijf L.major promastigoten gedurende 6, 12, 18 en 24 uur. Voeg in een buis van 1,5 milliliter 24 microliter gereduceerd serummedium en één microgram synthetisch circuitplasmide toe.

Voeg in een andere tube van 1,5 milliliter 24 microliter gereduceerd serummedium en één microliter polyethylenimine of PEI toe. Ik meng goed door minstens 10 keer te pipetteren en vijf minuten op kamertemperatuur te incuberen. Breng het PEI-mengsel over in het buisje van 1,5 milliliter met het DNA en meng goed.

Incubeer de buis gedurende 10 minuten. Gooi het medium uit de putjes op de bodemplaat met 96 putjes wegdek en was de cellen drie keer met PBS. Voeg met een pipet druppelsgewijs het DNA-PEI-mengsel toe aan de cellen en schud de plaat voorzichtig.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie uur. Voeg vervolgens 200 microliter vers gereduceerd serummedium toe aan de cellen, schud de plaat voorzichtig en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gooi het medium de volgende dag weg.

Nadat u de cellen twee keer met PBS hebt gewassen, voegt u DMEM complete media met geneticine en doxycycline toe aan de cellen en incubeert u gedurende 24 uur. Simulatie van het synthetische circuit onthulde oscillerende dynamica in zowel SDHA als de tetracycline-repressor. De introductie van het synthetische circuit in Escherichia coli DH5-alfa resulteerde in getransformeerde kolonies die resistent waren tegen kanamycine, wat wijst op efficiënte transformatie.

Transfectie met het synthetische circuit en inductie met doxycycline verhoogden de GFP-expressie in IMT-cellen in de loop van de tijd aanzienlijk. Na transfectie en doxycycline-inductie werd een significante vermindering van de intracellulaire parasietbelasting waargenomen bij geïnfecteerde macrofagen. Cytokinespiegels van interleukine 10 en interleukine 12 waren het hoogst zes uur na infectie, zonder significant verschil waargenomen bij transfectie en inductie van synthetische circuits.

Een significante toename van tumornecrosefactor alfa, interferon-gamma en transformerende groeifactor bèta werd waargenomen in de 24-uurs IMTI-steekproef, wat wijst op de opregulatie van pro-inflammatoire cytokines.