Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Mitochondriale disfunctie wordt in verband gebracht met veel ziekten, met name neurodegeneratieve en metabole stoornissen. Daarom, als we kunnen begrijpen hoe mitochondriën worden gereguleerd door lysosomen, helpt dit om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen. In dit protocol hebben we een tweekleurige CLEM-methode gedemonstreerd om mitochondriaal lysosoomcontact te visualiseren.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie is een beeldvormingstechniek die de voordelen van lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie combineert. In dit protocol maximaliseren we het voordeel van CLEM met behulp van tweekleurige sondes om mitochondriaal lysosoomcontact te visualiseren. Het is een uitdaging om mitochondriën die afbreken in lysosomen duidelijk te onderscheiden met behulp van traditionele elektronenmicroscopiebemonsteringsmethoden.

Deze studie presenteert CLEM-resultaten met hoge resolutie die duidelijk het effectordomein van lysosomen en mitochondriën aantoonden. De tweekleurige methode werd gebruikt om mitochondriëneffectoren in lysosomen nauwkeurig te onderscheiden. Ons onderzoek heeft aangetoond dat de mitochondriën interageren met de lysosomen.

Ons onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriën op verschillende manieren interageerden met lysosomen als reactie op verschillende externe spanningen. Door de oorzaken en regulatoren van deze verschijnselen te bestuderen, zullen we inzicht krijgen in het begrijpen van intracellulaire mitochondriale kwaliteitscontrole. Om te beginnen kweek je HeLa-cellen met een dichtheid van één keer 10 tot de macht vijf in 35 millimeter glazen kweekschalen met roosterbodem.

Op de volgende dag, co-transfect de cellen bij 30%to 40%confluency met plasmiden gebruikend het transfectiereagens. Na transfectie worden de cellen gedurende 18 uur behandeld met dimethylsulfoxide of U18666A en bafilomycine A1. Verwijder voor confocale beeldvorming de kweekmedia en voeg onmiddellijk 250 microliter warme fixeeroplossing toe bij 30 tot 37 graden Celsius.

Verwijder onmiddellijk het fixeermiddel. Vervang het door 1,5 milliliter vers fixeermiddel en incubeer het 30 minuten op ijs. Was de cellen vervolgens drie keer gedurende 10 minuten elk met een milliliter ijskoude 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer.

Voeg vervolgens een milliliter koude 20-millimolaire glycine-oplossing toe om het aldehyde te blussen. Nadat de cellen 10 minuten op ijs zijn geïncubeerd, wast u ze drie keer gedurende 10 minuten in een koude natriumcacodylaatbuffer van 0,1 molair. Voeg vervolgens 500 microliter Amplex rode oplossing toe aan de monsterschaal en incubeer gedurende vijf minuten op ijs.

Verwijder daarna de Amplex rode oplossing en spoel de cellen drie keer gedurende 10 minuten elk met 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer. Gebruik een confocale microscoop om het gebied rond de cellen van belang in beeld te brengen in de scanmodus van drie bij drie tegels. Leg zowel differentieel, interferentiecontrast, als fluorescerende signalen vast om het raster en de letters op de rasterschotel te identificeren en op te nemen met behulp van een 40-voudig objectief.

Beeld de doelcellen af met een hoge vergroting met behulp van een 40-voudig objectief en verkrijg een Z-stack-beeld. Na het in beeld brengen van de rood gekleurde cellen van Amplex met een confocale microscoop, voeg je een milliliter 1% gereduceerd osmiumtetroxide toe bij vier graden Celsius en incubeer je gedurende een uur. Spoel het monster vervolgens drie keer gedurende 10 minuten elk met gedestilleerd water van vier graden Celsius.

Dehydrateer in een graduele ethanolreeks gedurende 15 minuten telkens bij kamertemperatuur. Meng nu ethanol met epoxyhars in volumeverhoudingen van drie op één, één op één en één op drie, en bereid in totaal 300 microliter van elk mengsel. Giet elk epoxyharsmengsel in de schaal en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Bereid vervolgens de inbeddingscapsule voor door deze te vullen met verse epoxyhars. Draai de buis of capsule ondersteboven in het interessegebied en plaats deze 48 uur in een oven op 60 graden Celsius om te polymeriseren. Dompel vervolgens het onderste glas en het polymeerblok onder in vloeibare stikstof om ze te scheiden.

Plaats het preparaatblok in de monsterhouder van de ultra microtoom en plaats het in het trimblok. Gebruik een scheermesje om de hars in een rechthoekige of trapeziumvorm rond het object van interesse te snijden. Plaats het bijgesneden preparaatblok in de monsterhouder en stel het diamantzaagblad af.

Snijd met behulp van een ultramicrotoom ultradunne plakjes op ongeveer 60 tot 70 nanometer van de platte ingebedde cellen. Verzamel de seriële secties op een met vorm gecoat sleufrooster voordat u ze op een hete plaat droogt. Kleur de secties daarna twee minuten met contrastvlek en loodcitraat gedurende één minuut.

Plaats vervolgens het rooster in de transmissie-elektronenmicroscoop of TEM-monsterhouder voor observatie. Identificeer op basis van het beeld van het differentiële interferentiecontrast van de lichtmicroscoop de doelcel van belang en breng het hele celgebied in beeld met behulp van overlappende afbeeldingen met een vergroting van 1.700 keer Om de correlatieve licht- en elektronenmicroscopiebeelden van HeLa-cellen te verkrijgen met behulp van ImageJ Fiji, start ImageJ Fiji en klik op bestand, nieuw, TrakEM2 leeg, en selecteer de opslagmap om een nieuw TrakEM2-project aan te maken. Sleep de onbewerkte gegevens van de tegelafbeelding naar de werkruimte om de gegevensset van de tegelafbeelding te openen.

Klik met de rechtermuisknop en selecteer de lijn, monteer alle afbeeldingen in deze laag en elastische niet-lineaire blokovereenkomsten. Klik vervolgens op OK om de standaardwaarden voor de overige parameters te accepteren. Klik vervolgens op de rechtermuisknop en selecteer exporteren, gevolgd door maak een platte afbeelding om een samengevoegde afbeelding te maken.

Klik vervolgens op bestand en opslaan als om de afbeelding op te slaan. Om het formaat van de fluorescentieafbeelding te wijzigen, opent u de software voor het vergroten van foto's. Klik op bestand, open en selecteer de afbeelding.

Voer de breedte en hoogte in. Om overeen te komen met de grootte van het beeld van de elektronenmicroscoop. Selecteer het algoritme dat moet worden toegepast in de methode voor het wijzigen van het formaat.

Klik op bestand en sla op om de verkleinde afbeelding op te slaan. Open ImageJ Fiji en sleep de verkleinde fluorescentie en de samengevoegde elektronenmicrofoto naar de werkruimte. Klik op plug-ins, big data viewer en big warp om de registratie te starten.

Klik vervolgens op het vervolgkeuzemenu om de fluorescentiemicrofoto als bewegend beeld en de elektronenmicrofoto als doelafbeelding te selecteren. Met behulp van functies zoals zoomen, beeldrotatie en verplaatsen, vergelijkt u de fluorescentie- en elektronenmicrofoto's. Druk op de spatiebalk op het toetsenbord om over te schakelen naar de oriëntatiepuntmodus en druk op de linkermuisknop om ten minste drie oriëntatiepunten te markeren die in beide afbeeldingen worden geïdentificeerd.

Nadat u alle geïdentificeerde oriëntatiepunten hebt gemarkeerd, gaat u naar bestand, exporteert u bewegend beeld en klikt u op OK. Er verschijnt een nieuw pop-upvenster met de getransformeerde fluorescentiemicrofoto. Klik op bestand en sla op om de getransformeerde fluorescentiemicrofoto op te slaan.

Als u de CLEM-afbeeldingen over elkaar heen wilt leggen, sleept u de getransformeerde fluorescentiemicrofoto en de samengevoegde elektronenmicrofoto naar de ImageJ-werkruimte. Klik op afbeelding, type en acht-bits kleur. Ga als volgt te werk om hetzelfde afbeeldingstype in te stellen voor zowel de fluorescentie- als de elektronenmicrofoto's.

Klik op afbeelding, kleur en kanalen samenvoegen. Om de afbeeldingen te combineren. Klik op bestand en sla op om de CLEM-afbeelding op te slaan.

Mitochondriën gevangen in lysosomen werden waargenomen in met bafilomycine A1 behandelde cellen, wat wijst op geremde autofagie en vermindering van de mitochondriale kwaliteit, terwijl controlecellen mitochondriën vertoonden die interageerden met, maar niet werden opgeslokt door lysosomen, de mitochondriale verstoring die werd waargenomen in controlecellen toonde aan dat mitochondriën lysosomen omringden in plaats van erdoor te worden opgeslokt. U18666A behandelde cellen vertoonden verhoogde interacties tussen mitochondriën en lysosomen, waarbij sommige lysosomen werden opgeslokt door mitochondriën.