Name: Het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties te detecteren bij muizen met milde traumatische hersenletsels. Deze methode verbetert de detectie van neurale activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIGMS P20GM109089 en Department of Defense PR200891 subsidies.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het Institute's Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de University of New Mexico. C57BL/6J muizen werden verkregen van een commerciële bron. Er werden gelijke aantallen van mannelijke en vrouwelijke muizen gebruikt binnen de leeftijdscategorie van 8-14 weken. Alle muizen wogen ongeveer 20 g. Details van de dieren, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel van materialen. Aanvullende bestand 1 bevat de lijst met afkortingen.
1. De schedel voorbereiden voor beeldvorming en elektrofysiologie
<ol>
	<li>Verdoofd het dier in een isofluraan inductiebox met 2%-3% isofluraan in 100% zuurstof, waarbij u de juiste anesthesiegradiënt controleert zonder dat het dier reageert op een klauwknijpen.</li>
	<li>Dier vooroperatief pijnstillers toedienen (Slow-release Buprenorfine, 3,25 mg/kg, SQ) voordat het dier in een stereotactische frame wordt geplaatst en de anesthesie wordt gehandhaafd (2% isofluraan).</li>
	<li>Voeg oogzalf toe en houd de lichaamstemperatuur van het dier op peil met een verwarmingskussen dat feedback van de lichaamstemperatuur heeft.</li>
	<li>Scheer het haar boven de schedel waar de snede zal worden gemaakt, langs de middenlijn van de oogfissuur tot lambda.</li>
	<li>Verwijder het geknipte haar voordat de huid wordt gesteriliseerd met een antiseptisch en desinfecterend scrub en oplossing. Eindig met 70% ethanol en herhaal dit drie keer om een steriele chirurgische plaats te garanderen.</li>
	<li>Maak met een #10 scalpelmes een snede langs de middenlijn van rostrale naar caudale, direct gevolgd door het aanbrengen van medisch kwaliteits cyanoacrylaatlijm op de incisie. Spreid de huid lateraal uit om de schedel bloot te leggen.</li>
	<li>Voeg nog een druppel of twee cyanoacrylaatlijm toe over de schedel om extra bescherming aan de schedel toe te voegen. 
	OPMERKING: De aanbrenging van lijm is tijdsgevoelig omdat de schedel begint te worden ondoorzichtig wanneer deze langer dan 10 s aan de lucht wordt blootgesteld. Dit zal de visualisatie van de SD door beeldvormingsmethoden belemmeren.</li>
	<li>Terwijl de lijm aan het drogen is, gebruik steriele chirurgische schaar om de incisiegrootte over de cerebellum te vergroten. Zodra de lijm is uitgehard, begin met de implantatie van schedelschroefelektroden.
	<ol>
		<li>Steriliseer schedelschroeven door een kralensterilisator gedurende 20-30 s voorafgaand aan implantatie.</li>
		<li>Plaats de schedelschroeven in een gebied dat ver verwijderd is van de SD-initiatieplaats om een open visueel venster te behouden. 
		OPMERKING: Voor chronische opnames in de primaire visuele cortex worden drie schedelschroeven gebruikt. De eerste schroef wordt ongeveer geplaatst op y = -6,00 mm vanaf de bregma, in de cerebellum, dient als referentie-elektrode. De opnameelektroden zijn gepositioneerd op y = -2,79 mm van bregma en x = ±2,5 mm van de middenlijn, binnen de linker en rechter hemisfeer.</li>
		<li>Met een boortje van 0,8 mm, boor pilootgaten door de schedel. Om schade aan het onderliggende weefsel te voorkomen, is -0,5 mm in z ideaal. Gebruik #00-90 schroeven die vooraf zijn gesoldeerd aan goudstiften met roestvrijstalen draad.</li>
		<li>Draai de schroeven in de schedel. 1,5-2 volledige draaien zal de schroef door de schedel krijgen en in contact komen met het corticale oppervlak.</li>
		<li>Wind overtollig draad rond de schroef, waarbij wat speling in de draad wordt gelaten voor latere plaatsing van het hoofdstadium.</li>
		<li>Gebruik dezelfde procedures om de andere schedelschroeven te plaatsen.</li>
		<li>Zodra alle schedelschroeven op hun plaats zitten, steek alle goudstiften in de gewenste hoofdstadiumconnector. Houd de connector op zijn plaats met behulp van de stereotactische arm en houd de connectorstiften dicht boven de schroefhoofden terwijl wordt gecontroleerd dat de draden niet raken.</li>
		<li>Verzegeld de hele ruimte met cyanoacrylaatlijm, zorg ervoor dat het beeldvormingsgebied voor de schedelschroeven niet wordt verstoord.</li>
		<li>Bouw tandencement op rond de basis van de goudstiften, zorg ervoor dat de goudstiften van de schedelschroeven niet zijn verbonden met de goudstiften in de hoofdstadium.</li>
		<li>Laat het tandencement uitharden voordat de hoofdstadiumconnector wordt verwijderd.</li>
		<li>Verwijder het dier uit het stereotactische frame en plaats het terug in de thuiscamer om te herstellen. Volg standaard postoperatieve zorg en houd dieren op een verwarmingskussen terwijl ze zich herstellen van anesthesie. 
		OPMERKING: Na de operatie werden de dieren alleen gehuisvest en dagelijks gecontroleerd op pijn. Volg de lokale institutionele richtlijnen voor pijnstilling. Als u een slow-release buprenorfine gebruikt, controleer op pijn en geef mogelijk een extra dosis na 72 uur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwijder alle objecten die zich kunnen verstrikken in de elektroden, inclusief huisvesting en verrijking. Gebruik standaard beddengoed met ad libium toegang tot voedsel en water. 
	OPMERKING: Laat een herstelperiode van twee dagen tussen operatie en opname.</li>
</ol>
2. Het detecteren van verspreidende depolarisaties met intrinsieke optische signaal (iOS) beeldvorming en AC- elektrofysiologie
<ol>
	<li>Verdoofd de dieren met 2% isofluraan in 100% zuurstof. 
	OPMERKING: Het beeldvormingsgedeelte van deze procedure duurt ongeveer 5 min en de hoeveelheid isofluraanblootstelling moet consistent zijn.</li>
	<li>Plaats het dier in een stereotactisch frame. Via de neuskoker, handhaaf 1%-2% isofluraan in zuurstof. 
	OPMERKING: Het is

Detecting Spreading Depolarization Using AC Amplifiers and Non-Invasive Imaging

<ol><li>Pietrobon, D., Moskowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaos+and+commotion+in+the+wake+of+cortical+spreading+depression+and+spreading+depolarizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).</li>
<li>Hartings, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+cortical+spreading+depolarizations+in+a+case+of+severe+brain+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Res%22%5BJournal%5D)">Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma.</a> Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).</li>
<li>Andrew, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Questioning+glutamate+excitotoxicity+in+acute+brain+damage%3A+The+importance+of+spreading+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization.</a> Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).</li>
<li>Andrew, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thecritical+role+of+spreading+depolarizations+in+early+brain+injury%3A+Consensus+and+contention%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocrit+Care%22%5BJournal%5D)">Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention.</a> Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).</li>
<li>Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPacheco%2C+J+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (6), (2019).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).</li>
<li>Pinkowski, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depolarizations+contribute+to+the+acute+behavior+deficits+associated+with+a+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).</li>
<li>Dreier, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+spreading+depolarizations+in+neurointensive+care%3A+Review+and+recommendations+of+the+COSBID+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).</li>
<li>Herreras, O., Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+potential+shifts+associated+with+recurrent+spreading+depression+and+prolonged+unstable+spreading+depression+induced+by+microdialysis+of+elevated+K%2B+in+hippocampus+of+anesthetized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats.</a> Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).</li>
<li>Boas, D. A., Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+speckle+contrast+imaging+in+biomedical+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Laser speckle contrast imaging in biomedical optics.</a> J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).</li>
<li>Hadjikhani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+migraine+aura+revealed+by+functional+MRI+in+human+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex.</a> PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).</li>
<li>Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Ca2%2B+and+Zn2%2B+to+spreading+depression-like+events+and+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury.</a> J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).</li>
<li>Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+reduces+deleterious+consequences+of+spreading+depolarizations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations.</a> Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).</li>
<li>Mané, M., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporo-spectral+imaging+of+intrinsic+optical+signals+during+hypoxia-induced+spreading+depression-like+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%28P%29H+fluorescence+transients+after+synaptic+activity+in+brain+slices%3A+predominant+role+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).</li>
<li>Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NAD%28P%29H+fluorescence+imaging+of+postsynaptic+neuronal+activation+in+murine+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices.</a> J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).</li>
<li>Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+pannexin-1+channels+are+not+molecular+routes+of+water+influx+during+spreading+depolarization-induced+dendritic+beading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+and+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading.</a> J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).</li>
<li>Chung, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+non-invasive+in+vivo+visible+light+detection+of+cortical+spreading+depolarizations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice.</a> J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%C2%B5Manager+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
<li>Soldozy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+in+the+setting+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury.</a> World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).</li>
<li>Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+intrinsic+signals%3A+Recent+developments+in+the+methodology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications.</a> J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).</li>
<li>Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+through+%26%2334%3Btransparent+skull%26%2334%3B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging through &#34;transparent skull&#34; in mice.</a> PLoS One. 12 (8), (2017).</li>
<li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li>
<li>Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+isoflurane+on+high-frequency+and+low-frequency+oscillations+in+the+cerebral+cortex+and+hippocampus+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats.</a> Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).</li>
<li>Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+improves+neuronal+recovery+following+spreading+depolarization+in+peri-infarct+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues.</a> J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).</li>
</ol>

Spreidende depolarisaties zijn cruciaal in verschillende ziektemodellen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte en migraine1. Nauwkeurige detectie van SD's is essentieel voor het begrijpen van hun rol bij acute gedragsstoornissen en/of de activering van het neuro-immuunsysteem na mild traumatisch hersenletsel (mTBI's)23,24. Om het risico van het missen van SD's bij gebruik van een enkele methode te beperken, is een multi-methodenbenadering noodzakelijk voor effectieve visualisatie en registratie van SD's.
Hoewel het combineren van technieken bevestiging van spreidende depolarisaties (SD's) mogelijk maakt, kan elke techniek potentiële valkuilen hebben. De beeldvormingstechnieken die in dit protocol worden beschreven, zijn toegankelijk voor de meeste laboratoria en zijn gedetailleerd door Zepeda en collega's25. Voorbereiding van het craniale venster is cruciaal, omdat ondoorzichtige vensters kunnen leiden tot onbesliste beelden26. Dit probleem kan worden beperkt door de blootstelling van de schedel aan lucht te minimaliseren voordat cyanoacrylaatlijm wordt aangebracht. Bovendien kan de doorzichtigheid van het venster worden verbeterd met een druppel minerale olie voorafgaand aan het beeldvormen. Bewegingsartefacten kunnen ook de bevestiging van SD's bemoeilijken, dus het minimaliseren van deze artefacten is essentieel voor het verkrijgen van heldere video. Om dit aan te pakken, is het belangrijk om het dier gedurende het hele beeldvormingsproces onder isofluraangebruik te houden27. Het gebruik van een neusdop vergemakkelijkt de efficiënte overdracht van het dier tussen de impactor en het opnamesetup. Het is van cruciaal belang om het dier snel na de impact weer onder de neusdop te plaatsen om zoveel mogelijk van de SD-voortplanting te kunnen vastleggen. In dit milde traumatisch hersenletsel (mTBI) model is opname gedurende ongeveer 4 minuten meestal voldoende om de volledige SD vast te leggen. Bij ernstiger TBI's kunnen echter spontane SD's worden gegenereerd door weefselschade28. Continu beeldvorming kan deze spontane SD's detecteren, maar langdurige isofluraannesthesie kan het moeilijk maken om hoogfrequente depressie waar te nemen. Spontane SD's kunnen met elektrofysiologie worden gedetecteerd door aanvullende depressies in hoogfrequente activiteit, maar het bevestigen van de relatie tussen depressie en SD is moeilijk zonder beeldvorming.
Met de ontwikkeling van Open-Ephys en Intan versterkers is in vivo elektrofysiologie nu toegankelijk voor veel laboratoria. Alle elektrofysiologische opnames vereisen de implantatie van schedelschroeven en/of elektroden. In dit protocol is er een latentieperiode van twee dagen tussen de implantatie van schedelschroeven en de opname om herstel te ondersteunen. Hoewel deze periode mogelijk niet voldoende is voor het volledige herstel van de hersenen na de implantatie, zou er minimale schade moeten zijn, aangezien de schedelschroeven geen hersenweefsel doorboren. Bovendien neemt de doorzichtigheid van de met cyanoacrylaat verzegelde schedel in de loop van de tijd af, dus beeldvorming moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om optimale doorzichtigheid te bereiken. Voor elektrofysiologie is het cruciaal om 60 Hz ruis te minimaliseren. Zorg ervoor dat het experimentele gebied is geïsoleerd van AC-stroom en goed is geaard op de Intan versterker. Hoewel bewegingsartefacten niet volledig kunnen worden geëlimineerd, kunnen versnellingsmeters op de hoofdtrap helpen bij het identificeren en verwijderen van periodes van beweging tijdens post-processing. Al met al kunnen deze technieken waardevolle inzichten bieden in SD-herstel en corticale netwerkfunctie na mild traumatisch hersenletsel (mTBI's).
Een beperking van deze technieken is dat de dieren tijdens het beeldvormen onder narcose zijn. Echter, de meeste TBI-modellen vereisen narcose, en de verlengde narcose zal waarschijnlijk niet significant van invloed zijn op het experimentele ontwerp. Isofluraan vermindert significant de hoogfrequente activiteit27. Als isofluraannesthesie zich uitstrekt tot voorbij de beeldvormingsperiode, kan dit de detectie van hoogfrequente activiteitsherstel na de SD bemoeilijken. Daarom is het van cruciaal belang om een sham of isofluraange-alone groep op te nemen in het experimentele ontwerp om de herstel van hoogfrequente activiteit te vergelijken, zoals getoond in Figuur 2. Een andere beperking is dat elektrofysiologische opnames de DC-verschuiving niet detecteren. De amplitude en duur van de DC-verschuiving zijn indicatoren voor weefselgezondheid en herstel van de SD28. Desondanks zal het bevestigen van SD's met deze technieken nog steeds waardevolle inzichten bieden in TBI-onderzoek.
Alle TBI-onderzoekers zouden kunnen profiteren van de hier beschreven technieken, aangezien het zeer waarschijnlijk is dat alle TBI-modellen spreidende depolarisaties (SD's) produceren. Het TBI-veld zou aanzienlijk kunnen profiteren van het begrijpen van de rol van SD's bij letsel, letselprogressie, neuro-immuunactivering en herstel. Recent onderzoek suggereert dat SD's bijdragen aan gedragsstoornissen en mogelijk een onderliggend mechanisme zijn van neurologische beperking5,7. De in dit protocol geschetste technieken zullen helpen bij het verduidelijken van het verband tussen TBI en SD. Toekomstige toepassingen van deze technieken kunnen zich uitstrekken tot andere onderzoeksgebieden, waaronder beroerte, epilepsie en migraine.

Spreading depolarisaties (SD's) worden geassocieerd met verschillende neurologische aandoeningen, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte, subarachnoïdale bloedingen, ischemie en migraine-aura1. SD's zijn betrokken bij de progressie van weefselbeschadiging bij beroertes en TBI's2. Het exacte mechanisme achter de progressie van weefselverlies blijft onduidelijk3,4. Echter, SD's treden op wanneer de metabolische behoeften van neuronen niet worden gedekt door voldoende zuurstof en glucose, omdat de functie van de ATP-afhankelijke natrium-kaliumpomp ontoereikend wordt om ionengradienten te handhaven. Om de rol van SD's bij weefselverlies te begrijpen, zijn precieze technieken nodig om ze te meten en te bestuderen, wat cruciaal is voor het bevorderen van wetenschappelijke kennis. SD's zijn belangrijke neurologische gebeurtenissen die vaak onopgemerkt blijven vanwege beperkingen in experimenteel ontwerp en/of instrumentatie.
De rol van spreading depolarisaties (SD's) bij de progressie van verwondingen wordt momenteel onderzocht, maar hun rol bij milde traumatisch hersenletsel (mTBI's) blijft onduidelijk. Recente studies met behulp van de technieken die in dit manuscript worden beschreven, hebben aangetoond dat SD's worden geïnitieerd in muismodellen met gesloten schedel mTBI, zelfs wanneer er geen overduidelijk weefselbeschadiging of bloeding is5,6. Deze studies suggereren dat SD's kunnen bijdragen aan acute neurologische beperkingen en neuro-ontsteking. Bovendien is de aanwezigheid van mTBI-geïnduceerde SD's nauw verbonden met acute gedragsdeficiënten6,7. Daarom is het waarschijnlijk dat SD's worden geïnitieerd in alle TBI-modellen, maar hun rol blijft moeilijk vast te stellen zonder bevestiging. Het bevestigen van de aanwezigheid van SD's is cruciaal voor het nauwkeurig beoordelen van de uitkomsten van mTBI's.
Spreading depolarisaties (SD's) worden geïdentificeerd door een significante daling van het extracellulaire potentieel, bekend als de "DC-verschuiving," en door een onderdrukking van hogefrequentieactiviteit8. De "DC-verschuiving" duurt meestal seconden om zich op te lossen (~10 s)9. Om de "DC-verschuiving" vast te leggen, zijn een DC-versterker en zilverdraadelektroden vereist. Echter, in vivo elektrofysiologie wordt meestal uitgevoerd met AC-versterkers, die zijn ontworpen om laagfrequente gebeurtenissen te filteren om bewegingsartefacten te verminderen. Helaas verwijdert deze laagfrequente filtering ook de "DC-verschuiving." Bovendien is zilver giftig en ongeschikt voor chronische opnames. Gewoonlijk gebruikte AC-versterkers kunnen de onderdrukking van hogefrequentieactiviteit detecteren, maar zonder de bijbehorende "DC-verschuiving," is het bevestigen van de aanwezigheid van een SD een uitdaging.
Spreading depolarisaties (SD's) kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van verschillende beeldvormingstechnieken. Meestal worden SD's beeldvormd met laser speckle contrast beeldvorming, die de cerebrale bloedstroom door de intacte schedel meet10. SD's hebben een significante invloed op de cerebrale vaatbundel en de bloedstroom. Bij de meeste soorten, behalve muizen, induceren SD's een voortplantende golf van hyperperfusie die met de voorste rand van de SD reist11. SD's kunnen ook worden beeldvormd met behulp van calcium- of glutamaatfluorescente indicatoren12, hoewel dit vereist dat weefsel wordt geladen met kleurstoffen of genetisch gecodeerde fluorescente indicatoren12,13. Interessant is dat SD's kunnen worden waargenomen met het blote oog vanwege intrinsieke optische signalen (iOS) die geassocieerd zijn met de SD14. iOS zijn complexe signalen die bestaan uit autofluorescente moleculen zoals NAD(P)H en FADH15,16, weefselzwelling17 en mogelijke veranderingen in de cerebrale bloedstroom. Ondanks hun complexiteit zijn iOS-signalen betrouwbaar en kunnen ze worden vastgelegd bij wild-type muizen18. Dit protocol beschrijft de methode voor het beeldvormen van iOS omdat deze techniek in elk lab kan worden geïmplementeerd zonder de noodzaak van gespecialiseerde virussen of transgene dieren.
Het algemene doel van deze methode is om experimenteel de aanwezigheid of afwezigheid van een spreading depolarisatie (SD) na een mild traumatisch hersenletsel (mTBI) te bevestigen met behulp van gelijktijdige beeldvorming en elektrofysiologie. In vivo elektrofysiologie, vergemakkelijkt door geavanceerde versterkers, is een veelgebruikte techniek. Echter, deze versterkers zijn niet in staat om de karakteristieke "DC-verschuiving" te detecteren. Daarom worden beeldvormingstechnieken, zoals beschreven in dit protocol, gebruikt om met vertrouwen de aanwezigheid of afwezigheid van SD's te bevestigen. Het voordeel van het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie is dat beeldvorming de voortplanting van de SD kan detecteren, terwijl elektrofysiologie de geassocieerde onderdrukking van hogefrequentie kan identificeren.
Over het algemeen is deze methode geschikt voor het onderzoeken van de aanwezigheid van spreading depolarisaties (SD's) na een traumatisch hersenletsel (TBI). De toepassing ervan zou het begrip van de corticale netwerkfunctie na TBI en SD's kunnen verbeteren. Dit protocol kan worden aangepast van een gesloten schedel impactmodel naar andere modellen, zoals gecontroleerde corticale impact, vloeistof per

<table><tbody><tr><td>#00-90 x.118 Machine Screw</td><td>US Micro Screw</td><td>00.90-118-M-SS-P, Amazon</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm diameter drill bit</td><td>PCB Drill Bit</td><td>WYTP21, Amazon</td><td></td></tr><tr><td>16-A Headstage</td><td>Intan&nbsp;</td><td>C3335</td><td></td></tr><tr><td>2.1 mm Burrs micro drill bit</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-21</td><td></td></tr><tr><td>AC amplifier</td><td>Intan</td><td>RHD recording system</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>Jax#000664</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Mightex</td><td>TCE-1304-U</td><td></td></tr><tr><td>Extension lens</td><td>Zeikos&nbsp;</td><td>ZE-ETN</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (slow release Buprenorphine)</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>Product Number 267.10000.3</td><td></td></tr><tr><td>Gold connector pin (female)</td><td>A-M Systems</td><td>520100</td><td></td></tr><tr><td>Gold connector pin (male)</td><td>A-M Systems</td><td>520200</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ2/Fiji</td><td>Image J</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Impactor One</td><td>Leica</td><td>39463930</td><td></td></tr><tr><td>LED panel board</td><td>Supon</td><td>L122t</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Institutional or individual activation code</td><td></td></tr><tr><td>Medical grade cyanoacrylate glue</td><td>MasterBond</td><td>MB287</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager Camera Software</td><td>Image J</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nail drill/polisher</td><td>Makartt Nail Drill Electric Nail File</td><td>JD700</td><td></td></tr><tr><td>Omnetic connectors</td><td>Omnetics</td><td>A79014-001</td><td></td></tr><tr><td>RHX Data Acquisition Software</td><td>Intan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel uncoated wire (0.005")</td><td>A-M Systems</td><td>792800</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic Frame</td><td>Kopf Intruments</td><td>1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Teets 'cold cure' dental cement</td><td>A-M systems</td><td>525000, 526000</td><td></td></tr><tr><td>XLR camera lens</td><td>Nikon</td><td>NIKKOR 50 mm f/1.8-16</td><td></td></tr></tbody></table>

het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren

Combining Imaging and Electrophysiology to Visualize and Record Spreading Depolarizations in Mice

Spreidende Depolarisaties (SD's) zijn enorme gebeurtenissen in de hersenen die vaak onopgemerkt blijven vanwege hun langzame voortplanting door grijze stof. Omdat SD-detectie moeilijk kan zijn, wordt het optimaal bevestigd met behulp van meerdere methoden. Dit protocol beschrijft methoden voor het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om SD's te detecteren op een manier die de meeste laboratoria betrouwbaar en eenvoudig kunnen toepassen. SD's treden op na traumatisch hersenletsel, beroerte, subarachnoïdale bloedingen, ischemie en migraine-aura. Historisch zijn SD's opgenomen met behulp van DC-versterkers, die de langzame extracellulaire verschuiving en de depressie in hogefrequentieactiviteit kunnen oplossen. Echter, DC-versterkers zijn bijna onmogelijk te gebruiken voor chronische in vivo opnames. Dit protocol gebruikt een gewone AC-versterker voor in vivo elektrofysiologische opnames om de depressie met hoge frequentie te bevestigen, samen met niet-invasieve beeldvorming die noodzakelijk is om de voortplantende golf van SD te detecteren. Deze methoden kunnen betrouwbaar worden toegepast en/of aangepast voor de meeste experimentele benaderingen om de aanwezigheid of afwezigheid van SD's na hersenletsel te bevestigen.

Figuur 1 illustreert een grafische weergave van de experimentele opstelling. De schedelvijzen voor registratie zijn gepositioneerd in de primaire visuele cortex, waarbij één schedelvijze-elektrode in de cerebellaire vermis is geplaatst als geelektrode. De schedelvijzen en gouden pinnen zijn met cyanoacrylaatlijm en tandcement aan de schedel bevestigd. Het is cruciaal om het tandcement te beperken tot het caudale deel van de schedel om ruimte over te laten voor de impact en beeldvorming. De impactlocatie, gecentreerd op de middenlijn en ongeveer 1 mm rostraal ten opzichte van het bregma, wordt aangegeven in Figuur 1.
Representatieve beelden van intrinsieke optische signalen (iOS) zijn weergegeven in Figuur 2A. Grijswaardenbeelden worden geconverteerd met een Fire Lookup Table om de visualisatie van spreidende depolarisaties (SD's) te verbeteren. De iOS omvat verschillende signalen, waaronder NAD(P)H, FADH en weefselreflectie, waardoor interpretatie en vergelijking van deze signalen uitdagend is. Grote vaten moeten duidelijk zichtbaar zijn door het superglue-venster (aangegeven met pijlen), terwijl de stippellijn in Figuur 2A markeert waar de propagerende golf van de SD zich bevindt. Hoewel SD's moeilijk in real-time waarneembaar zijn, worden ze duidelijker wanneer de beelden worden versneld (zie Aanvullende Video 1). Sommige kleine takken kunnen lijken te "verdwijnen" als gevolg van vasoconstrictie (Figuur 2A). Een klein interessegebied (ROI), geëxtraheerd uit de beeldstapel, moet een Z-as plot opleveren vergelijkbaar met Figuur 2B. Uit de elektrofysiologische registraties moet het geëxtraheerde hoogfrequente signaal lijken op de bovenste panelen van Figuur 2C,D. Deze registraties werden onmiddellijk na het milde traumatische hersenletsel (mTBI) gestart, waarbij de dieren gedurende de 4 min van de iOS-beeldvorming onder isofluraan-anesthesie bleven. Na het stoppen van de isofluraan moet de hoogfrequente activiteit bij sham-dieren binnen een minuut snel terugkeren, zoals getoond in Figuur 2C (rood kader). Omgekeerd, als er een SD optrad, zou de hoogfrequente activiteit gedurende enkele minuten onderdrukt blijven vóór herstel (Figuur 2D, rood kader). De onderste panelen van Figuur 2C,D tonen het berekende vermogen (V²) voor elke hoogfrequente plot. Deze vermogenplots helpen bij het identificeren van de onderdrukking en het herstel van de hoogfrequente activiteit door de snelle stijging van het vermogen (aangegeven door de rechterrand van de rode kaders).
<img alt="Diagram van hersenimpact met blootgestelde schedel, schedelschroeven en tandcement voor onderzoek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67032/67032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Experimentele opstelling en locatie van de impact en schedelschroeven. Het dorsale oppervlak van de schedel wordt blootgelegd via een huidincisie. De schedel en huid worden afgedicht met cyanoacrylaatlijm om de transparantie te vergroten. Er wordt een boorgat voor de aarding geboord op y = -6.00 en x = 0 vanaf bregma. Boorgaten voor registratie-elektroden worden geplaatst op y = -2.79 en x = ±2.5 vanaf bregma. Roestvrijstalen schroeven worden door de schedel gedraaid en met ongecoat roestvrijstalen draad aan gouden pinnen gesoldeerd. Er wordt zorgvuldig gewerkt om overmatige bedekking van het schedeloppervlak met tandcement te vermijden, zodat er voldoende ruimte blijft voor impact en beeldvorming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/67032fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Analyse van de cerebrale bloedstroom; optische beeldvorming; paneelvergelijking; grafieken van hoogfrequente activiteit." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67032/67032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2Representatieve iOS-beelden en AC-opnamen. (ARepresentatieve iOS-beelden met pijlen die bloedvaten aangeven. De grijswaardenbeelden zijn in ImageJ omgezet naar de Fire-lookup-tabel voor een verbeterde visualisatie. De gestippelde zwarte lijn geeft de voortplantende SD aan, gevisualiseerd als een golf van verhoogde intensiteit in de iOS. De SD is duidelijk zichtbaar bij het snel scrollen door de volledige beeldstapel. Het iOS-signaal weerspiegelt diverse fysiologische en metabole veranderingen geassocieerd met de SD, waaronder mitochondriale productie van NAD(P)H en FADH en neuronaal oedeem. Het zwarte kader markeert de regio van interesse (ROI) die is gebruikt om de curve in (B). Schaalbalk: 1 mm. (B) Representatieve trace van de iOS SD, uitgedrukt als percentage van de baseline. Het iOS-signaal stijgt en keert binnen ongeveer 60 s terug naar de baseline. Hoewel veranderingen in iOS-signalen klein zijn (ongeveer 10%), zijn ze voldoende om de SD te identificeren. In de AC-opnamen voor zowel sham (C) en SD (D) dieren; de bovenste sporen tonen hoogfrequente activiteit en de onderste sporen stellen het vermogen (V²) voor. Blauwe kaders geven perioden van isofluraan-anesthesie aan, terwijl het rode kader de herstelperiode van de hoogfrequente activiteit na isofluraan en SD aanduidt. De verlengde depressie die door SD wordt geïnduceerd, staat in contrast met het snelle herstel van de activiteit na enkel isofluraan (sham). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/67032fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende video 1: Visualisatie van de voortplantende golf. Het videobestand is versneld tot ongeveer 8x de snelheid om de visuele identificatie van de voortplantende golf te vergemakkelijken. Het grijswaardenbeeld is geconverteerd naar de Fire-opzoektabel en opgeslagen als een .AVI-bestand in ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/iOS_movie_V2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Lijst van afkortingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67032/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol toont de combinatie van beeldvorming en elektrofysiologie om betrouwbaar verspreidende depolarisaties in volwassen muizen na een lichte traumatische hersenbeschadiging te detecteren.

Het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren

Spreading Depolarizations (SDs) are massive events in the brain that often go undetected due to their slow propagation through gray matter. Because SD ...

combining-imaging-electrophysiology-to-visualize-record-spreading

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een methode ontwikkeld voor gelijktijdige functionele magnetische resonantie imaging en elektrofysiologische opname in het knaagdieren hersenen, een platform te bieden voor het onderzoek van de relatie tussen de neurale activiteit en het bloed zuurstof niveau afhankelijk (BOLD) MRI-signaal.

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Deze methode zorgt voor een tastbaar, vertrouwde omgeving voor de muis te navigeren en te verkennen tijdens microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames, die stevige fixatie van het hoofd van het dier nodig heeft.

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

Hier presenteren we een protocol om te slaan van de hersenen en hart bio signalen in muizen met behulp van gelijktijdige video, elektro-encefalografie (EEG) en elektrocardiogram (ECG). Ook beschrijven we methoden voor het analyseren van de resulterende opnamen van het EEG-ECG voor vangsten, EEG spectrale vermogen, hartfunctie en hartfrequentie-variabiliteit.

Gelijktijdige Video-EEG-ECG controle om te identificeren Neurocardiac dysfunctie in muismodellen van epilepsie

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties te detecteren bij muizen met milde traumatische hersenletsels. Deze methode verbetert de detectie van neurale activiteit.

Het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren (Video) | JoVE Journal

Het combineren van beeldvorming en elektrofysiologie om verspreidende depolarisaties bij muizen te visualiseren en te registreren

Meer video's verkennen