Name: Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Ontdek langdurige monitoring van zuurstofverbruik in retinale pigmentepitheelculturen met het Resipher-apparaat. Deze methode maakt gedetailleerde bioenergetische profilering mogelijk onder ideale omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Drs. Daniel Hass en Jim Hurley voor het idee om de oplosbaarheid van O2 te testen in nieuwe versus geconditioneerde media als controle. We danken Dr. Magali Saint-Geniez voor de redactionele input op het manuscript. We danken Scott Szalay van Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, voor het achteraf uitrusten van de hypoxiekamer met de Resipher USB-kabel. Er werden geen federale fondsen gebruikt voor HFT-onderzoek. De Electronic Services Core wordt ondersteund door P30 EY007003 van het National Eye Institute. Dit werk wordt ondersteund door een onbeperkte afdelingssubsidie van Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. wordt ondersteund door het James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, de E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, een Eversight eye-bank grant, een K08EY033420 grant van het National Eye Institute en steun van Dee en Dickson Brown, evenals de David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. wordt ondersteund door het UNSW Scientia-programma. L.A.K. wordt ondersteund door de Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, een R01EY027739 beurs van het National Eye Institute en het Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Nieuw OCR-monitoringsysteem voor gedifferentieerde RPE-culturen

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

Richard A. Bryan en Kin Lo zijn werknemers van Lucid Scientific, dat het Resipher-systeem produceert.

Het mitochondriale metabolisme van de RPE speelt een cruciale rol in de pathogenese van veel voorkomende verblindende netvliesaandoeningen, waaronder AMD en PVR. Door het mitochondriaal metabolisme van RPE in vitro te modelleren, kan men de metabolische toestand isoleren van die van de omliggende weefsels, en het weefsel op een gecontroleerde manier onderwerpen aan verschillende ziekte-simulerende beledigingen. Een dergelijke in vitro modellering van het mitochondriale metabolisme van RPE is mogelijk gemaakt door de komst van high-fidelity humane primaire en iPSC-RPE-culturen die de juiste differentiatietoestand en polariteit bereiken die nodig zijn om RPE in vivo nauw te benaderen. Hoewel het monitoren van het zuurstofverbruik (OCR) in dergelijke culturen een ideale methode is voor het monitoren van het mitochondriaal metabolisme, sluit de opzet voor OCR-monitoring vaak groeiende culturen uit in de omstandigheden die nodig zijn voor sterk gepolariseerde en volledig gedifferentieerde RPE. Hier beschrijven we Resipher als een nieuw systeem voor het monitoren van RPE mitochondriaal metabolisme via real-time, langdurige beoordeling van OCR in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde RPE-culturen.
Andere methoden zijn gebruikt om OCR in RPE te monitoren. De Seahorse XF Analyzer is ontworpen om OCR gedurende korte perioden te bewaken met acute manipulaties van de mitochondriale functie. Seahorse-assays vereisen echter dat cellen worden gekweekt op aangepaste platen, die niet bevorderlijk zijn voor het ondersteunen van hoge RPE-polariteit en differentiatie21. Calton, Vollrath en collega's hebben het zeepaardje aangepast voor de beoordeling van sterk gedifferentieerde RPE-culturen gekweekt op microporeuze steunen door het microporeuze membraan in stukken te snijden en in de Seahorse-plaat te plaatsen, maar deze methode werkt nog steeds alleen voor kortetermijn, eindpuntbewaking van culturen omdat de cellen geen toegang hebben tot CO2 Tijdens de test kan de test alleen worden uitgevoerd onder niet-steriele omstandigheden, en het doorsnijden van de microporeuze ondersteuning zal na verloop van tijd de dood en disfunctie van het randgedeelte van de microporeuze ondersteuning veroorzaken22. De Barofuse is een pomploos perfusiesysteem waarbij stroken RPE gekweekt op microporeuze dragers in het perfusiesysteem kunnen worden geladen, waardoor OCR in realtime kan worden gemonitord23. Net als bij de aangepaste opstelling voor het zeepaardje door Calton, Vollrath en collega's, zijn de belangrijkste beperkingen van RPE-beoordeling met Barofuse de noodzaak om de microporeuze steunen te snijden en het kortetermijn, eindpunt van de test. De Oxygraph is ook ontworpen voor snelle kinetische veranderingen in OCR als reactie op metabole manipulaties24. Het is niet gebruikt voor RPE-culturen en zou dezelfde beperkingen ondervinden bij het beoordelen van sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen als het zeepaardje en de barofuse.
In tegenstelling tot deze andere methoden, maakt het hier beschreven OCR-systeem het mogelijk om OCR te monitoren terwijl RPE wordt gekweekt in standaard celcultuurplaten/substraten onder standaardomstandigheden met standaard RPE-media in een standaard CO2-incubator voor celcultuur, waardoor zeer gedifferentieerde en gepolariseerde RPE-culturen gemakkelijk en gemakkelijk kunnen worden gesondeerd. Naast het genereren van gegevens over real-time OCR-veranderingen door het systeem, kunnen diezelfde cellen worden gebruikt voor aanvullende tests aan het einde van de OCR-bewakingsperiode. Dit maakt zeer flexibele experimenten mogelijk waarbij het effect van een interventie op OCR herhaaldelijk wordt getest gedurende een periode van weken (bijv. - RPE EMT-inductie in figuur 5) of waar het herstel op lange termijn van een interventie kan worden getest (bijv. - herstel van mitochondriale ontkoppeling in figuur 3) of waar trapsgewijze metabole veranderingen als reactie op een initiële interventie kunnen worden gevolgd (bijv. - effecten van serum op OCR zodra medianutriënten zijn uitgeput in figuur 2). Het OCR-systeem in dit artikel is bijzonder handig voor het meten van OCR in sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen. Dergelijke culturen zijn functioneel postmitotisch, met een strakke verpakking en zware pigmentatie. Dit betekent dat elk putje bijna identieke celnummers9 bevat, waardoor het voor de meeste experimenten niet nodig is om OCR te normaliseren naar celnummer. Zelfs wanneer normalisatie naar het celaantal vereist is, zorgen de zware RPE-pigmentatie en goed afgebakende celgrenzen ervoor dat de normalisatie kan plaatsvinden met een niet-invasief eenvoudig celgetal op basis van helderveldbeeldvorming. Voor experimenten met ongedifferentieerde RPE en RPE-proliferatie, zoals de EMT-experimenten in figuur 5, wordt het normaliseren van de OCR per put naar het celnummer noodzakelijk om te weten wat de OCR "per cel" is.
Buiten het netvliesveld is het systeem gebruikt om cellulaire ademhaling en metabolische activiteit te bestuderen in verschillende celtypen, waaronder pancreaseilandjescellen25, skeletspier26, eierstokkanker27, cardiomyocyten28 en zelfs hele organismen, zoals C. elegans29. Realtime, langdurige monitoring van OCR met behulp van het hier beschreven OCR-systeem onthulde belangrijke inzichten in bio-energetische verschuivingen en mitochondriale disfunctie in deze diverse ziektemodellen.
Het Resipher systeem heeft wel beperkingen. De methode voor het bepalen van OCR is fundamenteel anders dan de Seahorse Analyzer, BaroFuse of Oxygraph. Het vereist de vaststelling van een O 2-gradiënt om OCR te berekenen, en het kan uren duren om de gradiënt vast te stellen. Snelle kinetische experimenten, die in de andere systemen mogelijk zijn, zijn met dit systeem dus niet mogelijk. Bovendien heeft Resipher, in tegenstelling tot de andere systemen, geen injectiepoorten voor de snelle afgifte van kleine moleculen of het verzamelen van metabolieten. In plaats daarvan moet het sensordeksel worden verwijderd in een celkweekkap, waarbij medicijnen worden ingespijkerd of media worden vervangen, samen met handmatige verzameling van metabolieten die moeten worden geanalyseerd.
Voor het instellen en oplossen van problemen met een experiment met behulp van het OCR-systeem dat in dit document wordt beschreven, wordt het volgende aanbevolen. Ten eerste, minimaliseer de verdamping. Bedenk dat de O 2-gradiënt in de mediakolom boven de RPE-monolaag sterk afhankelijk is van de hoogte van kolom9, en dat het systeem OCR berekent op basis van de O2-gradiënt. Dus als er tijdens het experiment een duidelijke verlaging van de mediakolom is als gevolg van verdamping, zal de O 2-gradiënt veranderen, wat van invloed is op de OCR-metingen. Het is van cruciaal belang om de waterbak voor de incubator vol te houden, maar er wordt ook voorgesteld om water in alle ongebruikte putten van de plaat met 96 putjes te plaatsen. Verder hebben de putjes aan de rand van de plaat hogere verdampingssnelheden, dus deze putjes worden leeg gelaten van cellen in typische experimenten die hierboven zijn gepresenteerd. De vochtigheidssensor op het OCR-systeem kan helpen bij het bewaken van de luchtvochtigheid van de couveuse. In figuur 8A suggereert de daling van de luchtvochtigheid tijdens het experiment dat de waterbak van de couveuse leeg is. Naarmate de verdamping in de put versnelt, zullen de O 2-concentratiemetingen voor de put hoger klimmen en uiteindelijk "vlak" worden bij de atmosferische O2-concentratie (~200 μM) (Figuur 8A).
Ten tweede, controleer of de "sandwich" van het OCR-systeem op de juiste manier is gemonteerd. De metalen contactplekken aan de onderkant van het apparaat en de bovenkant van het sensordeksel moeten schoon zijn, zonder vuil dat volledig contact belemmert. Het apparaat en het sensordeksel moeten volledig vlak en gelijkmatig uitgelijnd op de plaat met 96 putjes worden bevestigd zonder enige kanteling. De USB-kabel die het apparaat met de hub verbindt, mag niet onder spanning staan, wat kan leiden tot koppel van de "sandwich" en beperking van de juiste beweging van het apparaat.
Ten derde, zorg ervoor dat het apparaat en de sensoren van het sensordeksel zijn gekalibreerd. Figuur 2B geeft aan hoe aan het begin van elk experiment snel kan worden gecontroleerd of de sensor goed werkt. Ten vierde, zorg ervoor dat een bepaalde put geen uitbijter OCR vertoont voorafgaand aan de experimentele manipulatie. Nadat de sensoren werken, kan het bepalen van de OCR-waarden voor alle putjes met cellen helpen bepalen of bepaalde putjes ongezonde cellen bevatten. Figuur 8B toont verschillende putten die een baseline OCR-beoordeling ondergaan, waarbij de blauwgekleurde put duidelijk een lagere OCR (en dus hogeO2-concentratie ) vertoont. Deze put is een uitbijter en moet worden uitgesloten van experimentele manipulatie.
Ten vijfde, minimaliseer omgevingsmanipulaties tijdens actieve OCR-metingen. De O 2-gradiënt is zeer gevoelig voor veranderingen in temperatuur, vochtigheid, CO2 -niveaus van de incubator en atmosferische druk. Het openen van de deur van de couveuse heeft een aanzienlijke invloed op deze factoren, waardoor tijdelijke verstoringen in de OCR-metingen worden veroorzaakt totdat de O 2-gradiënt van de mediakolom weer in evenwicht komt (Figuur 8C). Parameters die van invloed zijn op OCR kunnen worden bewaakt in de online interface van het systeem onder het tabblad "Omgeving" (Figuur 8A).
Ten zesde, bepaal het optimale mediavolume voor het experiment. Hoewel een onvoldoende mediavolume artefacten kan veroorzaken door overmatige verdamping (zie de eerste maatregel voor probleemoplossing hierboven) of voortijdige uitputting van voedingsstoffen in de media, beperkt een te hoog mediavolume de beschikbaarheid van O2 tot de RPE-monolaag, waardoor hypoxie9 ontstaat. Figuur 7 is een screenshot van de online calculator die beschikbaar is voor het bepalen van het effect van het mediavolume op de O2-concentratie bij de RPE-monolaag. De maximale OCR die mogelijk is voor een bepaald mediavolume wordt weergegeven in figuur 9A. Als de OCR-snelheid voor een bepaald experiment met een bepaald volume de snelheid benadert die wordt weergegeven in figuur 9A, dan benadert de O2-concentratie op de RPE-monolaag anoxie (0%) en is een lager mediavolume nodig. Over het algemeen moeten experimenten met mitochondriaal intensieve processen in RPE-cultuur mediavolumes hebben die niet groter zijn dan 75 μl per 96-putje.
Ten zevende, voer de juiste normalisatie uit om de effecten van een experimentele interventie op OCR te isoleren. Aangezien verschillende putten verschillende basislijn-OCR kunnen hebben, is het van cruciaal belang om voorafgaand aan een experimentele interventie basislijn-OCR-metingen voor elke put te verkrijgen. Trek de basislijn OCR af van de OCR na de experimentele interventie om de "Delta OCR" te verkrijgen, die het effect van de experimentele interventie op OCR aantoont. De methode voor het verkrijgen van "Delta OCR" wordt gedemonstreerd in figuur 3 en figuur 9B. Als men geïnteresseerd is in de effecten van een experimentele interventie op het vermogen van een andere experimentele interventie om OCR te induceren, is een extra normalisatiestap, de "Delta-Delta OCR", nodig. Een dergelijk voorbeeld wordt geïllustreerd in figuur 9B, waar het vermogen van palmitaat (één experimentele interventie) om verhoogde OCR te induceren (via inductie van β-oxidatie) afhangt van het type media voor de RPE-cultuur (een tweede experimentele interventie).
Minimaliseer ten slotte het risico op besmetting. Het systeem bewaakt OCR door een zuurstofsensor in de media boven de cellen te introduceren. Dit verhoogt het risico op infectie. Onverwachte dalingen van de OCR tijdens het experiment of een onverwacht lage OCR aan het begin van het experiment kunnen tekenen zijn van een infectie. Platen moeten actief worden gecontroleerd op infectie onder een celcultuurmicroscoop. Kruisbesmetting tussen platen met 96 putjes kan optreden als een sensordeksel wordt hergebruikt. Om dergelijke kruisbesmetting tot een minimum te beperken, moet men het hele deksel gedurende 20 minuten onderdompelen in 70% ethanol voor ontsmetting nadat een experiment is uitgevoerd, voordat het sensordeksel opnieuw wordt gebruikt in een nieuw experiment (zie protocolparagraaf 1.2.15).
Tot slot wordt een protocol gepresenteerd voor real-time, langdurige monitoring van het mitochondriale metabolisme in high-fidelity RPE-culturen via beoordeling van OCR met behulp van een nieuw systeem genaamd Resipher. Het kan worden gebruikt voor tal van toepassingen op sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen, in het bijzonder het onderzoeken van fysiologische metabolische eigenschappen van geïsoleerde RPE, evenals veranderd RPE-metabolisme in in vitro modellen van netvliesaandoeningen, waaronder AMD en PVR.

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van functioneel postmitotische, sterk gepolariseerde epitheelcellen die een barrière vormen tussen lichtgevoelige fotoreceptoren in het netvlies en hun bloedcirculatie, een capillair bed dat de choriocapillaris wordt genoemd. Net als de rol van glia-ondersteunende neuronen, voert de RPE talloze functies uit om fotoreceptoren te ondersteunen, waaronder fagocytose van de buitenste segmenten van fotoreceptoren, transport van voedingsstoffen en metabole ondersteuning voor fotoreceptoren, en afscheiding van essentiële groeifactoren, allemaal cruciaal voor het behoud van de visuele functie.
Degeneratie van de RPE ligt ten grondslag aan verschillende veel voorkomende degeneratieve aandoeningen van het gezichtsvermogen. Bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een van de meest voorkomende oorzaken van ongeneeslijk verlies van het gezichtsvermogen in de wereld, sterft de RPE af en lijden bovenliggende fotoreceptoren daarom aan een secundaire degeneratie. Bij proliferatieve vitreoretinopathie (PVR) verlaat de RPE in plaats daarvan zijn normaal rustige postmitotische toestand, prolifereert en dedifferentieert in een mesenchymale toestand (een zogenaamde epitheel-naar-mesenchymale overgang [EMT]) met veranderingen in het metabolisme. RPE-dedifferentiatie veroorzaakt een verlies van RPE-ondersteuning aan fotoreceptoren, terwijl het ook een meer fibrotische toestand veroorzaakt. Dit resulteert in zowel fotoreceptordegeneratie als RPE-geïnduceerde littekens, die beide verlies van het gezichtsvermogen veroorzaken 1,2.
Een groot deel van de ondersteuning van de RPE aan fotoreceptoren is metabolisch, en metabole ontregeling is een kritieke factor bij tal van netvliesaandoeningen, waaronder AMD en PVR. De RPE dient als een regulerende barrière tussen fotoreceptoren en hun bron van zuurstof en voedingsstoffen, de choriocapillaris. Dus wat de RPE kiest om te metaboliseren versus wat de RPE kiest om door te gaan van de choriocapillaris naar de fotoreceptoren, bepaalt sterk het metabolisme en de overleving van fotoreceptoren. Talrijke studies hebben aangetoond dat de RPE voor zijn normale gezondheid sterk afhankelijk is van het mitochondriale metabolisme, en dat fotoreceptoren in plaats daarvan sterk afhankelijk zijn van glycolyse3. Dit heeft het concept geïntroduceerd van complementaire, met elkaar verweven metabolische toestanden tussen fotoreceptoren en de RPE. In het bijzonder vermindert de RPE het metabolisme van geprefereerde fotoreceptormetabole substraten en gebruikt in plaats daarvan de bijproducten van het fotoreceptormetabolisme in combinatie met de metabolieten die fotoreceptoren niet consumeren. Bij ziekten zoals PVR en AMD zijn er sterke aanwijzingen dat de RPE meer glycolytisch wordt en minder afhankelijk is van het mitochondriale metabolisme; deze verschuiving naar RPE-glycolyse kan fotoreceptoren van metabolieten die het nodig heeft uithongeren, wat degeneratie veroorzaakt 4,5,6. Gezien hoe onderling afhankelijk RPE en fotoreceptormetabolisme zijn en hoeveel veranderd metabolisme ten grondslag ligt aan netvliesaandoeningen, is er grote belangstelling voor het modelleren en manipuleren van RPE-metabolisme voor therapeutische doeleinden.
Hoewel het bestuderen van het mitochondriaal metabolisme van RPE in vivo ideaal is, kunnen veel aspecten van het mitochondriaal metabolisme van RPE alleen praktisch worden onderzocht in een in vitro kweeksysteem. In de afgelopen decennia is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de richting van high-fidelity RPE-culturen, tot het punt dat de meest zorgvuldig verzorgde RPE-culturen nu worden gebruikt voor celvervangingstherapie in klinische onderzoeken bij mensen7. Om dergelijke high-fidelity culturen te behouden, moet de RPE maandenlang voorafgaand aan het experimenteren op bepaalde substraten in bepaalde media worden gekweekt. Onder deze omstandigheden zijn RPE-culturen maximaal gedifferentieerd en gepolariseerd, waarbij RPE in vivo wordt benaderd. Helaas is er momenteel geen apparatuur beschikbaar die het mitochondriaal metabolisme specifiek van de RPE in vivo kan meten. Hoewel zuurstofmonitoring van het capillaire netwerk van het netvlies in vivo is bereikt met behulp van elektronenparamagnetische resonantie (EPR) oximetrie8, is dit niet mogelijk voor RPE-analyse. Verschillen tussen RPE-metabolisme in vivo en in vitro zijn niet goed beschreven, maar van RPE-culturen is aangetoond dat ze een hoge mitochondriale activiteit hebben, vergelijkbaar met RPE in vivo 3,9, wat suggereert dat significant inzicht in het mitochondriale metabolisme van RPE kan worden verkregen met behulp van high-fidelity RPE-culturen.
Aangezien al het mitochondriale metabolisme leidt tot zuurstofverbruik, is het meten van RPE-zuurstofverbruikssnelheden (OCR) een getrouwe proxy voor het mitochondriaal metabolisme. Het meten van OCR in RPE-culturen was moeilijk, omdat de omstandigheden die maximale RPE-polarisatie en differentiatie bevorderen, vaak nauwkeurige OCR-metingen op lange termijn uitsluiten met de momenteel beschikbare technieken, zoals de Seahorse Analyzer. In dit methodedocument wordt een nieuw apparaat geïntroduceerd, de Resipher genoemd (hierna "het systeem" genoemd), dat continue meting van OCR gedurende weken mogelijk maakt in RPE gekweekt onder omstandigheden die polarisatie en differentiatie maximaal bevorderen. Het gemak waarmee OCR door dit systeem kan worden gemeten in RPE-cultuuromstandigheden die RPE-differentiatie en polarisatie maximaal bevorderen, is uniek onder bestaande OCR-meetapparatuur.
Dit document geeft tips en trucs voor het gebruik van het systeem met RPE-culturen, gevolgd door een demonstratie van twee specifieke toepassingen. Ten eerste wordt RPE EMT, dat PVR nabootst, geactiveerd door blootstelling aan transformerende groeifactor-bèta (TGFβ)1,10,11,12. Het systeem wordt gebruikt om te monitoren hoe het RPE-metabolisme evolueert tijdens het EMT-proces. Ten tweede wordt de rol van hypoxie in het RPE-metabolisme onderzocht met behulp van dit systeem. Hypoxie levert een belangrijke bijdrage aan de pathogenese van AMD, aangezien de choriocapillaris dunner wordt met de leeftijd van 13,14 jaar. Door dit systeem te combineren met hypoxiekamers kan men het veranderde RPE-mitochondriale metabolisme modelleren met de subtiele hypoxie die gepaard gaat met veroudering. Ten slotte wordt een online rekenmachine geïntroduceerd die gebruikmaakt van Resipher-gegevens om te kunnen bepalen of RPE-culturen zich in hypoxische, normoxische of hyperoxische omstandigheden bevinden. Dergelijke informatie is van cruciaal belang voor het trekken van conclusies over het RPE-metabolisme uit in vitro RPE-cultuurstudies.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32-channel Resipher lid</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A for Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inhibitor van Complex III van de elektronentransportketen</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Ontkoppelingsmiddel om mitochondriale ademhaling te verhogen</td></tr><tr><td>DMSO, celkweekkwaliteit</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Drager voor het reconstitueren van mitochondriale geneesmiddelen</td></tr><tr><td>Extracellulaire matrix coating substrates: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Extracellulaire matrix voor hfRPE</td></tr><tr><td>Extracellulaire matrix coating substrates: Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Extracellulaire matrix voor iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>Ontkoppelingsmiddel om mitochondriale ademhaling te verhogen</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison-Cyclodextrine</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia kamer</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Media Supplement</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O2 sensor</td><td>Sensit technology of Forensics Detectors</td><td>P100 of FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF&beta;2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Transformatiegroeifactor beta-2 om epitheliale-mesenchymale overgang te induceren</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Remmer van Complex I van de elektronentransportketen</td></tr><tr><td>Systeem-compatibele plaat</td><td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;MEM (Alpha Modificatie van Eagle's Media)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

Het mitochondriale metabolisme is van cruciaal belang voor de normale functie van het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag van cellen in het netvlies die belangrijk is voor de overleving van fotoreceptoren. RPE mitochondriale disfunctie is een kenmerk van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld, en proliferatieve vitreoretinopathie (PVR), een verblindende complicatie van netvliesloslatingen. RPE-degeneratieve aandoeningen zijn goed gemodelleerd door RPE-cultuursystemen die sterk gedifferentieerd en gepolariseerd zijn om in vivo RPE na te bootsen. Het monitoren van zuurstofverbruikssnelheden (OCR), een proxy voor de mitochondriale functie, was echter moeilijk in dergelijke kweeksystemen omdat de omstandigheden die ideale RPE-polarisatie en differentiatie bevorderen, geen gemakkelijke OCR-metingen mogelijk maken. 
Hier introduceren we een nieuw systeem, Resipher, om OCR wekenlang te monitoren in goed gedifferentieerde RPE-culturen, terwijl de RPE op optimale groeisubstraten en fysiologische kweekmedia wordt gehandhaafd in een standaard celcultuurincubator. Dit systeem berekent OCR door de zuurstofconcentratiegradiënt te meten die aanwezig is in de media boven de cellen. We bespreken de voordelen van dit systeem ten opzichte van andere methoden voor het detecteren van OCR en hoe het systeem voor het meten van OCR in RPE-culturen kan worden opgezet. We behandelen belangrijke tips en trucs voor het gebruik van het systeem, voorzichtigheid bij het interpreteren van de gegevens en richtlijnen voor het oplossen van onverwachte resultaten. 
We bieden ook een online rekenmachine voor het extrapoleren van het niveau van hypoxie, normoxie of hyperoxie RPE-culturen op basis van de zuurstofgradiënt in de media boven cellen die door het systeem worden gedetecteerd. Ten slotte bespreken we twee toepassingen van het systeem, het meten van de metabolische toestand van RPE-cellen in een PVR-model en het begrijpen hoe de RPE zich metabolisch aanpast aan hypoxie. We verwachten dat het gebruik van dit systeem op sterk gepolariseerde en gedifferentieerde RPE-culturen ons begrip van het mitochondriale metabolisme van RPE zal vergroten, zowel onder fysiologische als onder ziektetoestanden.

We introduceren een nieuw apparaat voor het meten van zuurstofverbruik (OCR) in retinale pigmentepitheliale (RPE) culturen. Het apparaat kan OCR wekenlang meten op RPE die is gekweekt op standaard celkweekplaten met standaardmedia, terwijl de platen zich in een standaard celcultuurincubator bevinden.

Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

Real-time analyse van levend weefsel levert belangrijke functionele en mechanistische gegevens op. Dit artikel beschrijft de protocollen en kritische variabelen om te zorgen voor een nauwkeurige en reproduceerbare generatie van gegevens door een nieuw en pompvrij meerkanaals fluïdisch systeem dat een breed scala aan weefsel- en celmodellen onderhoudt en beoordeelt.

Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem

Dit onderzoek betreft de ontwikkeling en standaardisatie van een waardevolle methodologische protocol op lange termijn (14 dagen) dodelijke toxiciteit die wordt uitgeoefend door chemische stoffen, industrieel afvalwater of in de riolering en vloeibare milieu monsters op de zoutwater schaaldieren te...

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Chirp is een nieuwe en snelle techniek om genomische bindingsplaatsen van niet-coderende RNA's lang (lncRNAs) in kaart te brengen. De methode maakt gebruik van de specificiteit van anti-sense oligonucleotiden tegels aan de lijst van lncRNA-gebonden genomische locaties mogelijk te maken.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

De microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE) afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen (iPS-RPE), en foetale RPE, werden vergeleken.

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

De retinale pigment epitheel (RPE) is een multi-functionele epitheel van het oog. Hier presenteren we een protocol om primaire celculturen afgeleid van de lymfkliertest RPE.

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

Ontdek langdurige monitoring van zuurstofverbruik in retinale pigmentepitheelculturen met het Resipher-apparaat. Deze methode maakt gedetailleerde bioenergetische profilering mogelijk onder ideale omstandigheden.

Langdurige monitoring van zuurstofverbruiken in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde retinale pigmentepitheelculturen

Meer video's verkennen