Verbetering van de resultaten van studenten met een aanpasbare cursus moleculair klonen Cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring

Mijn onderzoeksgroep richt zich op de fundamentele moleculaire biologie en biochemie van biosynthetische assemblagelijnen in bacteriën. Ons doel is om bacteriën te manipuleren om nieuwe antibiotica te maken. We zijn gepassioneerd om dit werk in de klas te brengen en studenten praktische ervaring te bieden in geavanceerde technieken in de biotechnologie.

Klonen op basis van topoisomerase wordt momenteel gebruikt in het Cal Poly-klaslokaal voor niet-gegradueerde moleculaire biologie om studenten kennis te laten maken met moleculair klonen. Gibson Assembly is naar voren gekomen als een industrieel relevante moleculaire kloontechniek en we proberen studenten toepasbare ervaringen te bieden. Moleculair klonen is een techniek die moeilijk te conceptualiseren kan zijn in een traditioneel niet-gegradueerd klaslokaal.

We hebben een hands-on laboratoriummodule ontworpen waarin studenten hun experiment ontwerpen en evalueren en bijdragen aan authentieke onderzoeksprojecten. Dit vergroot hun begrip van het kloonproces en de toepassingen van hun werk. Hoewel er andere op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaringen zijn gepubliceerd die gebruik maken van moleculaire kloontechnieken, bevat geen enkele een aanpasbare Gibson-assemblagemodule.

We hebben al het materiaal ontworpen om de leerresultaten te meten voor deze op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring. We hopen dat dit zal dienen als een gemakkelijk te implementeren instrument voor wetenschappelijk onderwijs om de beoordeling van instructeurs en het onderwijs van studenten in moleculaire biologielaboratoria op universitair niveau te verbeteren. Bepaal om te beginnen de DNA-sjabloonbron voor de geninserts, zoals genomisch DNA, plasmide of synthetisch DNA.

Haal de DNA-sequenties van de geninserts en vector op. Importeer de gewenste insert-sequenties en vectorsequenties in Benchling als nieuwe DNA-sequentiebestanden. Open vervolgens elke geïmporteerde sequentie die moet worden gebruikt in de Gibson-assemblagereactie.

Zoek nu de tool Assembly Wizard onder aan het scherm. Klik op Assembly Wizard en selecteer vervolgens Nieuwe assembly maken. Selecteer Gibson uit de beschikbare opties en klik op Start om de assemblage te starten.

Selecteer in het venster Vectorsequentie de vectorruggengraatbasen vanaf het 3 priemgetallen van de geninsert tot het gewenste eindpunt. Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Backbone onder aan het scherm en kiest u Fragment instellen. Selecteer in het venster Invoegvolgorde alle invoegbases die in het merk moeten worden opgenomen.

Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm en kiest u Fragment instellen. Als er meerdere geninserts zijn, klikt u op de plusknop aan de rechterkant van de Assembly Wizard. Selecteer in het venster Invoegvolgorde alle basissen voor de extra wisselplaat die in het merk moet worden opgenomen.

Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm en kiest u Fragment instellen. Zodra alle fragmenten zijn ingesteld, wijzigt u de naam van de assemblage naar de gewenste plasmidenaam. Klik op Monteren aan de rechterkant van de montagewizard.

Selecteer vervolgens de gewenste maplocatie voor zowel de sequentiemap als de primermap en klik op Maken om de recombinante plasmidereeks samen te stellen. Open nu het geassembleerde plasmide en klik op Assemblagegeschiedenis om een basisplasmidekaart te bekijken en een overzicht van de sequenties waaruit het is afgeleid. Bekijk op het tabblad Assemblageparameters de namen van de primers die voor de assemblage zijn ontworpen.

Controleer of er twee primers zijn voor elke insert en of de primernamen zijn afgeleid van de titels van de DNA-sequentiebestanden. Zorg ervoor dat de smelttemperaturen van de primer en de voorgestelde gloeitemperaturen compatibel zijn. Zodra het primerontwerp voor de gewenste plasmiden is voltooid, klikt u op Voltooien in de montagewizard.

Met behulp van een gradiënt-PCR-experiment met de DNA-sjablonen kunnen zowel de insert- als de vectorspecifieke primerparen worden getest op optimale gloeitemperaturen. Zodra de gloeitemperaturen zijn bepaald, maakt u aliquots van primeroplossingen, DNA-sjablonen en noodzakelijke reagentia voor PCR-reacties voor studenten. Verkrijg om te beginnen primers en sjabloon-DNA-oplossingen voor PCR van de instructeur.

Bereid met behulp van de hier getoonde reagentia PCR-reacties van 25 microliter voor om lineaire fragmenten van de gewenste DNA-sequenties te verkrijgen. Cyclus de reactie in een thermocycler. Zorg ervoor dat de gloeitemperatuur geschikt is voor de primers en dat de verlengingstijd geschikt is voor de lengte van de gewenste amplicon.

Analyseer vervolgens vijf microliter van elke reactie via agarosegelelektroforese. Terwijl de gel draait, voeg je een microliter DpnI-restrictie-enzym toe aan elke reactie die plasmide-DNA als sjabloon gebruikte. Incubeer dit mengsel een uur bij 37 graden Celsius.

Breng vervolgens een afbeelding van de gel af om te bevestigen dat de PCR succesvol was en dat de juiste amplificatie werd bereikt. Zuiver eventuele succesvolle PCR-reacties met behulp van een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit. Meet de concentratie van het gezuiverde PCR-product met behulp van een microvolumespectrofotometer voor gebruik in latere Gibson-assemblageberekeningen.

Pipetteer de reactiecomponenten van de Gibson-assemblage. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 50 graden Celsius. Terwijl de reacties incuberen, ontdooien chemisch competente Escherichia coli-cellen op ijs voor transformatie.

Verander twee microliter van de Gibson-assemblagereactie in chemisch competente cellen via een hitteschok. Pipetteer 100 microliter van de getransformeerde cellen op twee selectieplaten en verspreid met gesteriliseerde kralen. Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius.

Bewaar het bord de volgende dag bij vier graden Celsius. Tel vervolgens kolonies op alle platen en bereken de transformatie-efficiëntie met behulp van de gegeven formule. Selecteer en label met behulp van een stift vier verschillende kolonies op het selectieplaatje met de initialen en een nummer van de leerling.

Neem een nieuwe LB-agarplaat met antibiotica voor selectie en verdeel deze in kwadranten. Gebruik ongeveer de helft van elke kolonie om opnieuw te resreteren naar het respectievelijke kwadrant. Voeg de juiste antibioticaconcentratie toe aan de buisjes die zijn gelabeld met kolonie-identiteit voor selectie.

Inoculeer vervolgens een vloeibare LB-cultuur van vijf milliliter met de andere helft van elk van de vier geselecteerde kolonies. Incubeer de vloeibare culturen in een schudbroedmachine bij 37 graden Celsius een nacht en de agarplaat in een statische broedmachine op dezelfde temperatuur. Isoleer plasmide-DNA uit de vloeibare culturen met behulp van een mini-voorbereidingskit.

Meet de concentratie van het geïsoleerde plasmide-DNA in nanogram per microliter. Na het ontwerpen van een PCR-scherm voor het verteren van restricties om de geïsoleerde plasmiden te analyseren, pipetteert u de restrictie-digestreacties of PCR-reacties. Analyseer vervolgens de resultaten door middel van gelelektroforese.

Zodra de Gibson-assemblagemodule is voltooid, vraagt u de studentdeelnemers om de meerkeuzevragenlijst in te vullen tijdens de labvergadering. Combineer alle gegevens van de antwoorden voor en na de vragenlijst voor analyse en beoordeel hun statistische significantie. Na het project steeg de gemiddelde inhoudsscore aanzienlijk van 63,7% naar 80,4%, wat wijst op een beter begrip van moleculaire biologie en kloonconcepten van studenten.

De gemiddelde termbetrouwbaarheid nam significant toe van 3,52 naar 3,87, waarbij een grote effectgrootte een beter begrip van moleculaire biologietermen aantoonde. Het vertrouwen van de gemiddelde student in het uitvoeren van laboratoriumtechnieken nam aanzienlijk toe van 3,82 naar 4,33, wat wijst op een verbeterd comfort met moleculair-biologische technieken. Het aantal antwoorden dat aangeeft bekend te zijn met de term Gibson-assemblage nam aanzienlijk toe van pre- tot post-vragenlijst, met een opmerkelijke toename van degenen die de term konden verklaren.

Het vertrouwen in het uitvoeren van de Gibson-assemblagetechniek verbeterde bij de meeste reacties, waarbij werd verschoof van neutraal of oneens voor de sessie naar eens of zeer eens erna. Het vertrouwen van studenten in algemene biologieonderwerpen vertoonde geen statistisch significante veranderingen. Daarentegen nam het vertrouwen in gespecialiseerde Gibson-assemblagevragen aanzienlijk toe.