CIRCLE-Seq voor ondervraging van off-target genbewerking

Ons team is toegewijd aan het ontwikkelen van geïnduceerde pluripotente stamceltherapieën, iPSC-therapieën, voor ernstige, momenteel ongeneeslijke huidziekten zoals recessieve dystrofische epidermolysis bullosa. We willen bepalen of nauwkeurige genbewerking in combinatie met de differentiatie van iPSC in huidcellen een levensvatbare behandelingsoptie kan bieden voor deze aandoeningen. Genbewerking in somatische cellen en iPSC's met behulp van CRISPR-Cas9-technologie transformeert regeneratieve geneeskunde door gepersonaliseerde therapieën mogelijk te maken voor verschillende ziekten, waaronder genetische huidaandoeningen.

De huidige uitdagingen op het gebied van genetische manipulatie zijn onder meer off-target effecten van geneditors. De therapie vereist geneditors die het gen van interesse nauwkeurig corrigeren zonder andere locaties in het genoom te veranderen. Onze uitdaging is om aan te tonen dat geneditors geen onbedoelde bewerkingen introduceren buiten het doelgen.

Het CIRCLE-seq-protocol maakt het mogelijk om bonafide potentiële off-target sites te identificeren die andere vergelijkbare technieken misschien missen. Een uitgebreide analyse van deze off-target sites biedt waardevol inzicht in de activiteit van genoomeditors, waardoor de veiligheid van gentherapieën wordt verbeterd, waaronder onze IPSC-gebaseerde therapie voor huidziekten. Na vijf dagen geïnduceerde pluripotente stamcellen te hebben gekweekt, verzamelt u de cellen door centrifugatie en suspendeert u ze opnieuw in 10 milliliter PBS.

Meng zes microliter celsuspensie in zes microliter trypanblauw voor het tellen van cellen. Na het tellen twee maal 10 aliquot tot de macht zeven cellen per buisje. Centrifugeer de cellen bij 300 G gedurende drie minuten bij 25 graden Celsius en gooi de supernatant weg.

Bereid de gefocusseerde ultrasoonapparaat voor door de bedieningsarm te richten. Vul het reservoir met gezuiverd, gedeïoniseerd water. Ga op de laptop van het controlestation naar waterleidingen en klik op vullen om het systeem te vullen.

Stel de temperatuur in op 4,5 graden Celsius. Breng 25 microgram genomisch DNA geïsoleerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen over in een microbuisje. Vul de tube tot een totaal volume van 130 microliter met TE-buffer.

Stel de voorwaarden in om het DNA af te schuiven op een gemiddelde lengte van 300 basenparen, een duur van 10 seconden, een piekvermogen van 70, een inschakelfactorpercentage tot 20 en cycli die barsten tot 50. Verdeel het afgeknipte genomische DNA in twee porties van elk 65 microliter. Zuiver de monsters met 1,8 keer het volume van XP-kralen, gevolgd door scheiding van magnetische rekken.

Breng het bovenstaande over op een nieuwe PCR-plaat en meet de DNA-hoeveelheid met behulp van een spectrofotometer. Laat ten slotte een microliter van het genomische DNA van de aangeduide afschuiving op een tapestation lopen. Suspendeer om te beginnen oSQT1288 en de haarspeldadapter tot een eindconcentratie van 100 micromolair in TE-buffer.

Meng voor adaptergloeien 40 microliter oSQT1288, 10 microliter 10X STE en 50 microliter nucleasevrij water om een totaal volume van 100 microliter te bereiken. Meng na het gloeien van de adapter 10 microliter 5X ligatiebuffer, vijf microliter DNA-ligase en vijf microliter gegloeide haarspeldadapter, pipetteer 20 microliter van de hoofdmix van de adapterligatie in elk geëlueerd DNA-monster dat kralen bevat. Plaats de monsters gedurende een uur in een thermocycler bij 20 graden Celsius en houd ze vervolgens voor onbepaalde tijd op vier graden Celsius.

Breng vervolgens 50 microliter PEG/NaCl-spuitoplossing over naar het adapter-ligated DNA. Zuiver de monsters met behulp van XP-kralen en magnetische rekscheiding. Elueer de monsters met 30 microliter TE, buffer pH acht en decanteer de supernatanten in een nieuwe halfrok PCR-plaat.

Combineer de monsters en kwantificeer het DNA met behulp van de dsDNA BR-assay. Om de circularisatiemastermix te bereiden, combineert u acht microliter nucleasevrij water, 10 microliter 10X TD4 DNA-ligasebuffer en twee microliter T4 DNA-ligase voor een totaal volume van 20 microliter. Pipetteer 20 microliter van de circularisatiemastermix op 80 microliter 500 nanogram DNA behandeld met gebruiker PNK.

Incubeer het monster in een thermocycler bij 16 graden Celsius gedurende 16 uur. Voeg de volgende dag 100 microliter XP-kralen toe aan het cirkelvormige DNA en zuiver de monsters, zoals eerder gedemonstreerd. Elueer het monster met 38 microliter TE-buffer en decanteer het bovenstaande in een nieuwe halfrok PCR-plaat.

Om gezuiverd circulair genomisch DNA te splitsen, bereidt u in vitro splitsingsmastermix door vijf microliter 10X Cas9-buffer, 4,5 microliter Streptococcus pyogenes Cas9 en 1,5 microliter genomisch RNA te combineren voor een totaal volume van 11 microliter. Incubeer de decolletémastermix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. om de Cas9 gRNA RNP-complexen te vormen.

Verdun 125 nanogram plasmide-veilig DNase-behandeld genomisch DNA tot een eindvolume van 39 microliter in nucleasevrij water. Voeg vervolgens 11 microliter van de cleavage master-mix toe aan de 39 microliter DNA voor een totaal volume van 50 microliter. Incubeer het mengsel een uur in een thermocycler bij 37 graden Celsius en houd het voor onbepaalde tijd op vier graden Celsius.

Voeg na incubatie 50 microliter XP-kralen toe aan het in vitro gesplitste DNA en zuiver het DNA op een magnetisch rek. Elute het gezuiverde DNA in 42 microliter TE-buffer. Voor de analyse van sequencinggegevens van de volgende generatie installeert u Python versie 2.7, Burrows-Wheeler Aligner en SAMtools.

Download het referentiegenoom van de gegeven website. Definieer het referentiegenoom FASTA-bestand, de uitvoermap voor de analyse en de paden naar de BWA- en SAMtools-opdrachten. Specificeer de doelsequenties en de paden naar de gedemultiplexte FASTQ-bestanden voor zowel de nuclease-gesplitste als de controlemonsters.

Voer de standaardanalyse op basis van verwijzing uit met behulp van de volgende opdracht. Zoek bij het uitvoeren van de volledige pijplijn de uitvoerresultaten van elke stap in een afzonderlijke uitvoermap die voor die specifieke stap is aangewezen.