Name: In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Verken een geavanceerd in vitro-model dat substraatstijfheid en stroming combineert om endotheelcelreacties te bestuderen. Deze methode simuleert het vasculaire milieu nauwkeurig voor onderzoek naar atherosclerose en hypertensie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs betuigen hun dankbaarheid aan Robert Egan voor zijn hulp bij het vervaardigen van de stroomkamer. De auteurs bedanken Lucas McCauley voor zijn hulp tijdens de experimenten. Daarnaast willen ze de kernfaciliteiten van het Institute for Chemical Imaging of Living Systems (CILS) van de Northeastern University erkennen voor het verlenen van toegang tot confocale microscopen. De auteurs erkennen de financiële steun die wordt verleend door de National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 toegekend aan SB) en de National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 aan SB en CMMI 1846962 aan EE).

Bestudering van weefselstijfheid en effecten van schuifspanning op endotheelcellen

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
<li>James, B. D., Allen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+behavior+in+complex+mechanical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).</li>
<li>Yeh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulates+endothelial+cell+proliferation+through+septin+9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9.</a> PLoS One. 7 (10), e4688(2012).</li>
<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Comm Biol. 4 (1), 764(2021).</li>
<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er een voorlopige octrooiaanvraag (nr. 63/634.853) is ingediend met de titel Stroomkamer met een mechanisch afstembaar substraat, en dat er geen andere concurrerende belangen bestaan.

Het vasculaire systeem is een dynamische omgeving waar verschillende krachten het cellulaire gedrag aanzienlijk beïnvloeden. Het bestuderen van biologische gebeurtenissen bij hart- en vaatziekten zonder rekening te houden met deze krachten zou onnauwkeurig zijn. Cellulaire modellen die in staat zijn om de vasculaire mechanische omgeving na te bootsen, zijn dus cruciaal. Onderzoekers hebben al aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het benadrukken van het effect van deze krachten op cellulair gedrag11</sup...

Endotheel, dat het binnenoppervlak van bloedvaten bekleedt, speelt een cruciale rol bij het behoud van de vasculaire gezondheid. Endotheelcellen (EC's) staan centraal bij het reguleren van verschillende cardiovasculaire functies, waaronder vaattoonregeling, selectieve permeabiliteit, hemostase en mechanotransductie 1,2. Onderzoek heeft EC-disfunctie stevig in verband gebracht met een primaire rol bij de ontwikkeling van atherosclerose. EC's ondervinden met name verschillende mechanische krachten op de grensvlakken waar ze interageren met de bloedstroom en onderliggende vaatweefsels 3,4. Verschillende onderzoeken hebben EC-disfunctie in verband gebracht met abnormale veranderingen in mechanische factoren binnen de vasculaire omgeving, zoals de vloeistofschuifspanning door de bloedstroom en weefselstijfheid 5,6,7.
Eerder onderzoek heeft echter beperkte aandacht gekregen om de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de EC-functie te begrijpen. Om het vermogen te vergroten om onderzoeksresultaten te vertalen naar effectieve behandelingen voor atherosclerose en andere hart- en vaatziekten, is het essentieel om de cellulaire modellen die in het veld worden gebruikt te verbeteren. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het humaniseren van cellulaire modellen door gebruik te maken van menselijke EC's en deze te onderwerpen aan schuifspanning of substraten met verschillende stijfheidsniveaus 8,9,10. De acceptatie en verfijning van cellulaire modellen die dynamische stromingsomgevingen integreren met EC-substraten met instelbare stijfheidseigenschappen is echter langzaam gevorderd. De uitdaging ligt in het ontwerpen van niet-zwellende EC-substraten om veranderingen in de stromingsparameters binnen het stromingskanaal te voorkomen en tegelijkertijd de teelt van intacte en goed hechtende EC-monolagen te vergemakkelijken. Een in vitro model dat in staat is om deze obstakels te overwinnen, zou effectiever onderzoek kunnen vergemakkelijken naar hoe hypertensie, veroudering en flowcondities samen van invloed zijn op EC-mechanotransductie, vasculaire gezondheid en, uiteindelijk, de ontwikkeling van atherosclerose. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om schuifspanning op cellen uit te oefenen en tegelijkertijd de stijfheid van het substraat te beheersen, waaronder roterende platen en microfluïdische apparaten. Bij de roterende plaatmethode worden cellen tussen twee platen geplaatst en wordt schuifspanning uitgeoefend door de roterende beweging van de platen. Deze methode is minder ingewikkeld en biedt een snel model; Het lijdt echter aan ruimtelijke schuifspanningsvariatie, met nul schuifspanning in het midden en maximale schuifspanning aan de periferie11.
Aan de andere kant vertegenwoordigen microfluïdische apparaten de nieuwe generatie gereedschappen met de mogelijkheid om de stijfheid van het substraat en de stromingsomstandigheden te regelen. Deze systemen zijn geschikt voor het nabootsen van microvasculaturen onder laminaire stromingsomstandigheden. Het bestuderen van atherosclerose met dergelijke apparaten is echter onpraktisch, omdat atherosclerose optreedt in grote bloedvaten met een verstoorde stroming11. Dit artikel heeft tot doel een bijdrage te leveren aan het kritische onderzoeksdomein van EC-studies door een kosteneffectief systeem te presenteren dat in staat is om de effecten van variërende stijfheidsniveaus in EC-substraten onder verschillende stromingsomstandigheden te onderzoeken. Het systeem integreert substraten met verschillende stijfheden om pathologische en fysiologische bloedvaten na te bootsen. Dit protocol schetst de methode voor het maken van hydrogels op basis van gelatine zonder zwelling en stijfheidsniveaus van 5 kPa en 10 kPa, die respectievelijk fysiologische en pathologische stijfheid vertegenwoordigen. Bovendien is de constructie van een stromingskamer met parallelle platen die in staat is om deze substraten te integreren, gedetailleerd. Computational fluid dynamics (CFD) werd gebruikt om schuifspanning en stromingsomstandigheden te evalueren. De bereiding van hydrogels voor EC-cultuur en de uitvoering van een 6 uur flow experiment worden beschreven, gevolgd door een bespreking van immunokleuring na het experiment.

<table><tbody><tr><td>(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Hydrogel Fabricage</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)Propyl Methacrylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Glass Salinization</td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-containing mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Immunoskleuring</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Synthese</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8953S</td><td>Immunoskleuring</td></tr><tr><td>Ammonium Persulfaat (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Hydrogel Fabricage</td></tr><tr><td>Heldere kras- en UV-bestendige gietacrylplaat (45/64'')</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>Flow Chamber Fabricage</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>Immunoskleuring</td></tr><tr><td>Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Spuiten zonder naalden</td><td>Fisher&nbsp;&nbsp;</td><td>22-031-375</td><td>Flow Experiment</td></tr><tr><td>EC groeikit&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>Glass Salinization</td></tr><tr><td>Gelatine Type A (300 bloom) uit varkenshuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Synthese</td></tr><tr><td>Glazuur Azijnzuur</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Glass Salinization</td></tr><tr><td>Hoogzuivere hoge temperatuur siliconenrubberplaat</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>Flow Chamber Fabricage</td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endotheelcellen (HUVEC)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PSC-100-010</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>M3x30mm Machineschroeven Hex Socket Ronde Kop Schroef 304 Roestvrijstalen Bevestigingen Bouten 20 stuks</td><td>Uxcell</td><td>B07Q5RM2TP</td><td>Flow Chamber Fabricage</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive met Easy-Load&reg; 3 Pompkop voor Precisiebuizen; 115/230 VAC</td><td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td><td>Flow Experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Precisiepompbuis, Puri-Flex, L/S 25; 25 ft</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>Flow Experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>Methacrylzuuranhydride (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA Synthese</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td>Algemeen</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA Synthese</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA Synthese</td></tr><tr><td>SOLIDWORKS educatieve versie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Flow Chamber Ontwerp</td></tr><tr><td>Vasculair basaal medium</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>Celcultuur</td></tr></tbody></table>

in vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

We presenteren een innovatief in vitro model gericht op het onderzoeken van de gecombineerde effecten van weefselstijfheid en schuifspanning op de functie van endotheelcellen (EC), die cruciaal zijn voor het begrijpen van de vasculaire gezondheid en het ontstaan van ziekten zoals atherosclerose. Van oudsher hebben studies de effecten van schuifspanning en substraatstijfheid op EC's onafhankelijk van elkaar onderzocht. Dit geïntegreerde systeem combineert deze factoren echter om een nauwkeurigere simulatie van de mechanische omgeving van het vaatstelsel te bieden. Het doel is om EC-mechanotransductie te onderzoeken over verschillende weefselstijfheidsniveaus en stromingsomstandigheden met behulp van menselijke EC's. We beschrijven het protocol voor het synthetiseren van gelatinemethacrylaat (GelMA) hydrogels met afstembare stijfheid en het bezaaien ervan met EC's om samenvloeiing te bereiken. Daarnaast beschrijven we het ontwerp en de assemblage van een kosteneffectieve stromingskamer, aangevuld met computationele vloeistofdynamicasimulaties, om fysiologische stromingsomstandigheden te genereren die worden gekenmerkt door laminaire stroming en passende schuifspanningsniveaus. Het protocol bevat ook fluorescentie-etikettering voor confocale microscopie, waardoor de beoordeling van EC-reacties op zowel weefselcompliantie als flowomstandigheden mogelijk wordt. Door gekweekte EC's te onderwerpen aan meerdere geïntegreerde mechanische stimuli, maakt dit model uitgebreid onderzoek mogelijk naar hoe factoren zoals hypertensie en veroudering de EC-functie en EC-gemedieerde vaatziekten kunnen beïnvloeden. De inzichten die uit deze onderzoeken worden verkregen, zullen een belangrijke rol spelen bij het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan vaatziekten en bij het ontwikkelen van effectieve behandelstrategieën.

Figuur 1 toont de experimentele opstelling en schetst het proces van GelMA-synthese door middel van een methacrylatiereactie. Het resulterende product werd vervolgens gebruikt om het hydrogelsubstraat te fabriceren, waarop EC's werden gezaaid. Vervolgens werden de cellen in de stroomkamer gebracht voor een 6 uur durend stromingsexperiment bij 12 dyne/cm2.
1H NMR-spectroscopie werd gebruikt om het succes van de methacrylatiereactie te beoordel...

We hebben een afstembaar substraat op basis van gelatine gesynthetiseerd en gekarakteriseerd voor het kweken van vasculaire endotheelcellen (EC's) onder relevante vasculaire stromingsomstandigheden. Dit biomimetische oppervlak repliceert zowel fysiologische als pathologische omstandigheden, waardoor de studie van mechanische krachten op het EC-gedrag mogelijk wordt en ons begrip van vasculaire gezondheid en ziektemechanismen wordt bevorderd.

In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Deze studie richt zich op de mechanobiologie in relatie tot atherosclerose en hypertensie. De belangrijkste vragen die we willen beantwoorden zijn: ten eerste, hoe kunnen we de vasculaire omgeving onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden nauwkeuriger nabootsen? Ten tweede, wat zijn de cellulaire reacties van endotheelcellen wanneer zij gelijktijdig worden blootgesteld aan deze mechanische stimuli?Deze studie heeft tot doel een nauwkeurigere simulatie van de vasculaire omgeving te bieden door substraatstijfheid en stroomcondities in één enkel systeem te integreren. Vorige in vitro-modellen onderzochten ofwel de substraatstijfheid onder statische condities, ofwel het effect van stroom op EC's gekweekt op een stijf substraat, wat beide fysiologisch irrelevant is. Begin met het toevoegen van 10 gram type A, 300 bloom gelatine van varkenshuid aan 100 milliliters carbonaat-bicarbonaatbuffer.Los de gelatine op in een waterbad van 55 °C terwijl de oplossing wordt geroerd op 700 RPM met een magnetische roerder. Zodra het volledig is opgelost, wordt de pH van de gelatinenoplossing bijgesteld naar 9.5 met behulp van 0.1 molar natriumhydroxide. Om de methacrylering te initiër

in-vitro-model-integrating-substrate-stiffness-flow-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Trombocyttransfusie en hemostase werden gemodelleerd met behulp van bloedreconstitutie en microfluïdische stroomkamers om de functie van bloedbanktrombocyt te onderzoeken. De gegevens tonen de gevolgen van trombocyt-opslageffect op hemostase, in vitro aan.

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Hele orgelcultuur van de tussenwervelschijf (IVD) behoudt het natieve extracellulaire matrix, celfenotypen en cellulaire-matrix interacties. Hier beschrijven we een IVD cultuur systeem met behulp van de muis lumbale en caudale IVD's in hun functionele spinale-eenheden en een aantal applicaties door middel van dit systeem.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Hier, wordt een workflow voor de cultuur en gen expressie analyse van endotheliale cellen onder vloeistof schuifspanning gepresenteerd. Inbegrepen is een fysieke schikking voor gelijktijdig huisvesting en bewaking van meerdere stroom kamers in een gecontroleerde omgeving en het gebruik van een exogene referentie RNA voor kwantitatieve PCR.

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

Verken een geavanceerd in vitro-model dat substraatstijfheid en stroming combineert om endotheelcelreacties te bestuderen. Deze methode simuleert het vasculaire milieu nauwkeurig voor onderzoek naar atherosclerose en hypertensie.

In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

Meer video's verkennen