Name: Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Ontdek hoe de neutrale komeettest DNA-breuken detecteert in delende menselijke cellen tijdens replicatiestress. Deze methode onderzoekt de rol van SNF2L in DNA-synthese en genoomstabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het Dungrawala-lab voor hun input en feedback. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidie R35GM137800 aan HD.

Dit protocol (Figuur 1) maakt voornamelijk gebruik van aanhangende U2OS-kankercellijnen, maar kan worden aangepast aan een breed scala aan aanhangende en suspensiecellen die in weefselkweek worden gekweekt. De oplossingen en buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van materialen
<ol><li>Plaats voorafgaand aan de dag van het experiment de meegeleverde fles met agarose met een laag smeltend gehalte (1% agarose met een laag smeltend alcoholgehalte in PBS) 5-10 minuten in een warmwaterbad om er zeker van te zijn dat de agarose volledig is gesmolten. NOTITIE: Verwarm de fles niet in de magnetron.</li>
	<li>Eenmaal gesmolten, voer dan snel 100 μl van de agarose uit tot 1,5 ml centrifugebuisjes naar behoefte en bewaar de buisjes bij 4 °C. De gestolde agarose kan maximaal 1 jaar bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Verwijder op de dag van het experiment het benodigde aantal centrifugebuisjes uit de opslag van 4 °C. Smelt de agarose door de buisjes in een warmteblok of waterbad van 42 °C te plaatsen. OPMERKING: Plaats de buisjes op 42 °C voordat de cellen worden geoogst om ervoor te zorgen dat de agarose volledig is gesmolten voor resuspensie (stap 3.7).</li>
	<li>Bereid op de dag van het experiment verse lysisbuffer en TAE-buffer en bewaar ze bij respectievelijk kamertemperatuur en 4 °C tot gebruik. Voeg daarnaast 1x PBS toe in een conische buis van 15 ml en plaats deze in de koelkast om te gebruiken in de resuspensiestap (stap 3.5).</li>
	<li>Markeer de monsteridentificaties op het matte uiteinde van de komeetglaasjes met 2 putjes en bewaar ze bij kamertemperatuur tot ze klaar zijn voor gebruik.</li>
</ol>2. Bereiding van de monsters
<ol><li>Zaai de cellen voorafgaand aan de dag van het experiment in een schaal met 6 putjes en kweek ze een nacht bij 37 °C met 5% CO2 . Voor U2OS-cellen werden voor elk monster ongeveer 2-3 x 105 cellen gezaaid. OPMERKING: Celnummers moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het celtype dat voor analyses wordt gebruikt.</li>
	<li>Behandel op de dag van het experiment cellen met de omstandigheden volgens het experimentele ontwerp. Als positieve controle om replicatie-afhankelijke breukinductie aan te tonen, behandelt u cellen met 1 μM CPT gedurende 1 uur. CPT is een topoisomerase-1-remmer die dubbelstrengsbreuken induceert op een replicatie-afhankelijke manier14.</li>
</ol>3. Celresuspensie en lysis
<ol><li>Zuig celkweekmedia op en spoel twee keer met 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 300 μL trypsine toe aan elk putje. Incubeer de schaal in een weefselkweekincubator gedurende 2-3 minuten. OPMERKING: Langdurige incubatie in trypsine kan valse resultaten opleveren tijdens komeetanalyses.</li>
	<li>Voeg 700 μL celkweekmedia toe aan elk putje. Resuspendeer voorzichtig en breng de monsters over in centrifugebuisjes van 1,5 ml. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om in deze stap cellen te tellen om in stap 3.6 de juiste celdichtheid te verkrijgen om de frequentie van overlappende staarten tijdens de analyse te verminderen.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 2400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zuig de media op en resuspendeer de cellen in 1 ml koude 1x PBS.</li>
	<li>Herhaal stap 3.4 en stap 3.5 twee keer en resuspendeer de cellen in koude 1x PBS met een celdichtheid van 2 x 105 cellen per ml. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de levensvatbaarheid van cellen in deze stap te beoordelen om er zeker van te zijn dat er voldoende levensvatbare cellen aanwezig zijn. Een levensvatbaarheid van ten minste 90% wordt aanbevolen.</li>
	<li>Resuspendeer 10 μL van de celsuspensie in 100 μL aliquot gesmolten agarose, meng met dezelfde pipetpunt voorzichtig en verdeel het mengsel gelijkmatig over een kuiltje van het objectglaasje. Herhaal deze stap indien nodig voor alle monsters. OPMERKING: Verwijder niet alle aliquots in één keer uit het waterbad van 42 °C om te voorkomen dat de agarose stolt. Deze stap moet bij voorkeur worden uitgevoerd door het waterbad en elk monster wordt geresuspendeerd en op een gespreide manier verspreid. Vermijd het introduceren van luchtbellen tijdens het verspreiden van de agarose op de glijbaan, aangezien de luchtbellen de migratie van de komeetstaarten tijdens elektroforese beïnvloeden (stap 4.5) en scheuren veroorzaken in de droogstap (stap 5.3)</li>
	<li>Bewaar de objectglaasjes 15-20 minuten in het donker bij 4 °C om er zeker van te zijn dat de agarose volledig is gestold (Figuur 2A).</li>
	<li>Plaats de objectglaasjes in Coplin-potjes en dompel de glaasjes 1 uur onder in lysisbuffer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de objectglaasjes één keer af met koude TAE-buffer en dompel de glaasjes 30 minuten onder in koude TAE-buffer bij 4 °C.</li>
</ol>4. Elektroforese
<ol><li>Plaats de elektroforetische kamer op een vlakke ondergrond en zet het systeem waterpas met behulp van de vier nivelleringsknoppen aan de randen van het apparaat. Plaats koude kompressen in de onderste kamer om de oplossing koud te houden tijdens elektroforese.</li>
	<li>Giet ongeveer ~850 ml koude 1x TAE-buffer in het apparaat.</li>
	<li>Verwijder de objectglaasjes van 4 °C en plaats ze op de elektroforesebak in de juiste richting om de migratie van gebroken DNA mogelijk te maken. OPMERKING: De lade biedt plaats aan tien objectglaasjes met 2 putjes. Plaats de objectglaasjes in het midden van de lade als u met minder monsters werkt. Als u met een oneven aantal dia's werkt, voeg dan een lege dia toe, zodat elke put plaats biedt aan 2 dia's.</li>
	<li>Plaats de meegeleverde overlay van de dialade voorzichtig op de lade om de dia's te bedekken. NOTITIE: Voor een goede werking van het apparaat mag het volume van de TAE-buffer niet lager zijn dan het onderoppervlak van de overlay en niet groter zijn dan het bovenoppervlak van de overlay.</li>
	<li>Stel na het aansluiten van de kabels het vermogen in op 21 V en voer elektroforese (1 V/cm) uit gedurende 40 minuten. OPMERKING: De elektroforesetijd moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het celtype dat voor analyses wordt gebruikt. Lange staarten in onbehandelde monsters duiden op een te lange looptijd. Omgekeerd kunnen korte staarten in positieve controlemonsters duiden op onvoldoende runtime.</li>
</ol>5. Vlekken
<ol><li>Verwijder na voltooiing van de elektroforese de objectglaasjes uit het apparaat en dompel ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder in een DNA-precipitatieoplossing.</li>
	<li>Gooi de DNA-precipitatieoplossing weg en dompel de objectglaasjes 30 minuten onder in een 70% ethanoloplossing bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi de 70% ethanoloplossing weg. Verwijder de glaasjes en droog ze 30 minuten in het donker in een hybridisatieoven op 45 °C (figuur 2B). NOTITIE: Objectglaasjes kunnen een nacht op een donkere, droge plaats worden bewaard voor de droogstap.</li>
	<li>Incubeer de putjes met 100 μL 1x SYBR Green oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Decanteer de SYBR Green-oplossing door de glaasjes te kantelen en verwijder het overtollige door de rand van het putje voorzichtig te deppen met een pluisvrij doekje.</li>
	<li>Leg de glaasjes in een lade en laat ze 30 minuten drogen.</li>
	<li>Ga verder met het maken van de dia's.</li>
</ol>6. Beeldvorming en analyses
<ol><li>Stel de microscoop in voor beeldvormingsdoeleinden. OPMERKING: Alle beelden zijn verkregen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. 10x vergroting met 0,45 numerieke apertuur werd gebruikt met een belichtingstijd van 1/40s en een versterking van +6dB. De opnamemodus van monochroom 8bit werd gebruikt met 2 x 2 binning en zwartbalanscorrectie.</li>
	<li>Plaats de objectglaasjes op de microscooptafel en begin met beeldvorming met behulp van het FITC-filter. NOTITIE: Gebruik eerst het onbehandelde monster om de belichtingstijd te testen. De meeste cellen vertonen geen komeetstaarten, omdat DNA compacter is. Schakel over naar de put met met sonde behandelde cellen en maak beeld met dezelfde belichtingstijd. Komeetstaarten met verhoogde lengtes zullen in dit monster worden waargenomen vanwege de migratie van gebroken DNA-uiteinden.</li>
	<li>Verkrijg beelden van ten minste 100 kometen per monster met dezelfde belichtingstijd voor drie technische replicaten. OPMERKING: Komeetstaarten aan het einde van dekglaasjes hebben de neiging om ongelijk te migreren en fungeren als uitschieters in de monsterverdeling. De meeste kometen die voor analyses zijn vastgelegd, bevinden zich dicht bij het midden van het dekglaasje (figuur 3).</li>
	<li>Exporteer afbeeldingen en scoor de kometen handmatig (met behulp van afbeelding J) of met behulp van gratis beschikbare komeetscoresoftware. Kometen die individueel te onderscheiden zijn en volledig in het gezichtsveld liggen, worden geselecteerd voor de score. Overlappende of gedeeltelijk zichtbare kometen worden niet in aanmerking genomen voor verdere analyses (Figuur 4). OPMERKING: Gebruikers kunnen kometen scoren op Image J met behulp van de volgende plug-in: https://cometbio.org/index.html. Details voor het scoren van kometen met behulp van CometScore-software zijn opgenomen in figuur 5.</li>
	<li>Plot staartmomenten verkregen uit de analyses als doos- en snorhaarplots die 10-90 percentielwaarden weergeven. Voer normaliteitstests uit om te bepalen of parametrische of niet-parametrische tests moeten worden gebruikt voor statistische analyses. OPMERKING: In de meeste gevallen worden niet-parametrische tests toegepast met behulp van de Mann-Whitney-test als alleen twee monsters worden vergeleken of de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn als ze drie of meer monsters vergelijken.</li>
</ol>

Onderzoek naar de mate van DNA-breuken die optreden tijdens DNA-replicatie 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dit protocol schetst een NC-test voor het beoordelen van DNA-breuken in menselijke cellen die actieve replicatie ondergaan. Het protocol is relatief eenvoudig uit te voeren en onderzoekers kunnen het gemakkelijk aanpassen aan hoge pH-omstandigheden voor alkalische analyses8. Het omvat twee kritieke stappen, zoals beschreven in de stappen 3.7 en 4.5. In stap 3.7 is het essentieel om de gesmolten agarose met cellen gelijkmatig over de put te verspreiden om te voorkomen dat kometen elkaar overlappen tijdens de analyse. Zorg ervoor dat cellulaire aggregaten zijn opgelost voordat u de cellen opnieuw in agarose resuspendeert. Door te voorkomen dat de pipetpunt loskomt tijdens het verspreiden van de agarose, wordt de introductie van belletjes tot een minimum beperkt. De voorwaarden voor elektroforese zijn cruciaal voor het bereiken van de juiste komeetstaartmigratie voor beeldvorming en analyse. Onderzoekers moeten rekening houden met de aard van de cellijnen die voor analyse worden gebruikt, aangezien de mate van staartmigratie en het percentage cellen dat komeetstaarten vertoont, varieert tussen celtypen (Figuur 9). Daarom wordt aanbevolen om de looptijd van de elektroforese empirisch te bepalen voordat er wordt geëxperimenteerd.
Als er geen komeetstaarten worden waargenomen in positieve controlemonsters (met CPT behandelde cellen), moet de werkzaamheid van het geneesmiddel parallel worden bevestigd met behulp van alternatieve benaderingen, zoals immunokleuring voor de DNA-schademarker γH2AX. Uitgebreide staartmigratie kan de analyse van breukinductie uitsluiten. Het minimaliseren van de elektroforesetijd en het beoordelen van de celmorfologie voorafgaand aan de analyse kan voorkomen dat te lange komeetstaarten worden verkregen. Onvoldoende droging van de objectglaasjes kan resulteren in wazige en wazige komeetbeelden. Zorg ervoor dat de agarose op het komeetglaasje gelijkmatig is gedroogd en platgedrukt voordat u deze kleurt met 1x SYBR-oplossing. Als het bereik van vouwinductie smal is, kan het uitvoeren van een dosis-responscurve met CPT helpen bij het bepalen van een optimaal werkbereik voor experimentele doeleinden. Door deze tips voor het oplossen van problemen toe te passen, kunnen de resultaten van deze tests worden gemaximaliseerd.
Deze testmethodologie is kosteneffectief en zeer gevoelig in vergelijking met andere technieken die worden gebruikt om inductie van DNA-breuk te bestuderen, zoals de Halo-test29,30, TUNEL-test31 en pulsed-field gelelektroforese32. De huidige testtechniek heeft echter bepaalde beperkingen. Het geeft geen precies aantal DNA-laesies, maar biedt een relatieve schatting van de accumulatie van breuken in vergelijking met onbeschadigde cellen. Bovendien kan het geen pauze-inductie beoordelen die optreedt op een celcyclusafhankelijke manier. Om veranderingen in pauze-inductie als gevolg van verschillen in de progressie van de celcyclus uit te sluiten, moeten celcyclusanalyses door middel van flowcytometrie parallel worden uitgevoerd.

De komeettest is een gelelektroforesemethode die wordt gebruikt om DNA-breuken op celniveau te detecteren. Het is gebaseerd op het principe dat DNA-breuken met een open einde migreren onder elektroforetische omstandigheden, terwijl intact DNA grotendeels statisch blijft. Gebroken DNA migreert omdat breuken resulteren in de ontspanning van supercoiled DNA, waardoor het geleidelijk ruimtelijk verplaatst naar de anode in de elektroforetische kamer, wat resulteert in een komeetachtig uiterlijk dat wordt waargenomen door immunofluorescentie 1,2. De omvang van DNA-schade wordt vervolgens gemeten door de hoeveelheid gebroken DNA te kwantificeren die is gemigreerd ten opzichte van het compacte DNA.
De twee meest gebruikte komeettestmethoden zijn de alkalische komeet (AC) test en de neutrale komeet (NC) test. De AC-test wordt uitgevoerd onder denaturerende omstandigheden met behulp van een oplossing met een hoge alkalische pH, terwijl de NC-test wordt uitgevoerd in een oplossing met een neutrale pH. Zowel NC- als AC-assays kunnen op betrouwbare wijze DNA-breuken detecteren die in de kern optreden. De alkalische versie is echter ook voordelig voor het detecteren van alkali-labiele plaatsen3. Beide formaten van de test vereisen het gebruik van lysisvoorwaarden om ervoor te zorgen dat DNA vrij is van eiwitten voorafgaand aan elektroforese.
Deze test is een eenvoudige methode voor het detecteren van DNA-breuken en biedt verschillende unieke voordelen voor het bepalen van cellulaire DNA-schade. De methode is relatief eenvoudig in te stellen en vereist reagentia die in het laboratorium kunnen worden bereid of bij commerciële leveranciers kunnen worden gekocht. Omdat het een techniek is met een resolutie van één cel, vereist de test zeer weinig uitgangsmateriaal. Met name de NC-test kan breuken met hoge gevoeligheid meten, naar verluidt tussen de 50 en 10.000 breuken per celdetecteren 4. De veelzijdigheid van deze techniek wordt aangetoond door het brede scala aan toepassingen, waaronder ecotoxicologie5, menselijke biomonitoring6 en genotoxiciteitsstudies7. De test kan ook op betrouwbare wijze worden gebruikt in verschillende celtypen en worden aangepast voor high-throughput-assays8 en voor het beoordelen van breuken in specifieke genomische regio's9. Deze test dient dus als een snelle en betrouwbare techniek voor het onderzoeken van breukvorming op het niveau van één cel.
Het proces van DNA-replicatie wordt voortdurend uitgedaagd door verschillende endogene en exogene stressoren10,11. Het vastlopen van replisomen als gevolg van dergelijke laesies kan DNA-breuken veroorzaken en resulteren in verhoogde genoominstabiliteit. DNA-breuken ontstaan ook vaak als replicatietussenproducten om DNA-herstel te vergemakkelijken12. Bovendien induceren verschillende chemotherapeutische middelen replicatieafhankelijke dubbelstrengsbreuken (DSB's), zoals camptothecine (CPT)13,14,15 en PARP-remmers 16,17. Deze test dient dus als een krachtige methodologie om de aard van DNA-laesies te bestuderen, de verwerking van replicatievorken te beoordelen en het therapeutisch potentieel van DNA-beschadigende middelen te onderzoeken. Aanpassingen van de test waarbij nieuw gesynthetiseerd DNA met BrdU wordt gelabeld, zijn nuttig geweest voor het bestuderen van replicatie-geassocieerde stressfenotypes 18,19,20,21. Met name de NC-test is een betrouwbare methode voor het bestuderen van DNA-breukinductie in de context van replicatie, zoals aangetoond in onderzoeken met de karakterisering van vorkeiwitten22,23, analyse van replicatietussenproducten24,25 en onderzoek naar transcriptie-replicatieconflicten bij genoomonderhoud26,27. Hierin schetsen we een NC-testprotocol met als doel DNA-breuken tijdens replicatie in menselijke cellen te kwantificeren. Dit protocol kan gemakkelijk worden geïmplementeerd door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van replicatiestressgerelateerde schade in een breed scala aan delende menselijke cellen.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R&amp;D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Electrophoresis System II</td><td>R&amp;D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Inclusief elektroforesetank, veiligheidsdeksel, kabels, 2/20 welplaten en platenoverlay</td></tr><tr><td>CometScore software</td><td>TriTek</td><td></td><td>open-sourced</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R&amp;D systems</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescentiemicroscoop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>hTERT-RPE-1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyureum</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>PARP-remmer Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Sterile weefselkweekschaal met oppervlaktebehandeling</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleïnezuur Gel Stain (10.000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp;HB-1000 Hybridisatie-incubator</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van dna-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

DNA-replicatie wordt voortdurend uitgedaagd door een breed scala aan endogene en exogene stressoren die DNA kunnen beschadigen. Dergelijke laesies die tijdens genoomduplicatie worden aangetroffen, kunnen replisomen vertragen en replicatievorken omzetten in dubbelstrengsbreuken. Als ze niet worden gerepareerd, kunnen deze giftige DNA-breuken chromosomale herschikkingen veroorzaken, wat leidt tot verhoogde genoominstabiliteit en een verhoogde kans op cellulaire transformatie. Bovendien vertonen kankercellen aanhoudende replicatiestress, waardoor het aanpakken van replicatievorkkwetsbaarheden in tumorcellen een aantrekkelijke strategie voor chemotherapie is. Een zeer veelzijdige en krachtige techniek om DNA-breuken tijdens replicatie te bestuderen, is de komeettest. Deze gelelektroforesetechniek detecteert op betrouwbare wijze de inductie en reparatie van DNA-breuken op het niveau van één cel. Hierin wordt een protocol geschetst waarmee onderzoekers de omvang van DNA-schade kunnen meten in mitotisch delende menselijke cellen met behulp van vorkaftrekmiddelen over meerdere celtypen. Door dit te koppelen aan geautomatiseerde komeetscores wordt een snelle analyse mogelijk en wordt de betrouwbaarheid bij het bestuderen van inductie van DNA-breuken verbeterd.

Analyse van breukinductie door replicatiestressreagentia U2OS-cellen werden behandeld met DMSO, 4 mM-hydroxyureum (HU) of 100 nM CPT gedurende 4 uur en geanalyseerd op breukaccumulatie door de NC-test (Figuur 6A). Terwijl CPT pauzes induceert tijdens de S-fase door topoisomerase-113 te blokkeren, blokkeert HU-geïnduceerde uitputting van nucleotidepools replicatievorken die geleidelijk worden omgezet in DSB's28. De gegevens geven aan dat blootstelling aan HU of CPT breukinductie in de S-fase veroorzaakt, die detecteerbaar is door NC-assay.
Analyse van breukinductie waarbij lysis bij verschillende temperaturen wordt vergeleken Onbehandelde U2OS-cellen werden geïncubeerd in lysisbuffer bij kamertemperatuur (RT) of 4 °C voorafgaand aan analyses van breukinductie (figuur 6B). De resultaten geven aan dat de temperatuur waarbij lysis wordt uitgevoerd een minimale invloed heeft op de migratie van staarten in de test.
Temporele analyse van breuken door hydroxyureum (HU) U2OS-cellen werden gedurende 4 uur en 8 uur onbehandeld of behandeld met 4 mM HU voorafgaand aan de analyses van breukinductie door de NC-test (figuur 7). De resultaten geven aan dat langdurig vastlopen van replicatievorken met HU ervoor zorgt dat replicatievorken instorten in DSB's.
Dosisafhankelijke analyse van pauzes door camptothecin U2OS-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met verhoogde doses CPT en geoogst voor pauzeanalyses met behulp van de NC-assay (figuur 8). Terwijl de accumulatie van breuken minimaal is in cellen die niet met CPT worden behandeld, neemt de mate van pauze-inductie geleidelijk toe bij verhoogde dosering van CPT, wat het nut van de test aantoont bij het bestuderen van dosisafhankelijke effecten op de accumulatie van breuken tijdens DNA-replicatie.
Vergelijkende analyse van breuken in meerdere celtypen Basale niveaus van DNA-breuken werden beoordeeld over drie uiteenlopende mitotische celtypen: hTERT onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen (hTERT-RPE-1), simian virus 40 (SV40), groot T-antigeen dat menselijke embryonale niercellen tot expressie brengt (HEK293T) en botosteosarcoomcellen (U2OS) (Figuur 9). Elke cellijn vertoonde differentiële migratie van staartmomenten in afwezigheid van extra replicatiestress, wat te wijten kan zijn aan verschillen in de verdeling van de celcyclus, de organisatie van chromatine of het aantal actieve replicatievorken. Elk celtype werd ook blootgesteld aan 1 μM CPT gedurende 1 uur om een toename van replicatie-afhankelijke DNA-breuken te valideren.
Analyses van breukinductie door AC-assay U2OS-cellen werden behandeld met DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT of 10 μM PARP-remmer (PARPi) Olaparib en geanalyseerd op pauze-inductie (Figuur 10). Cellen werden gedurende 2 uur behandeld met DMSO, HU en PARPi, terwijl CPT-behandeling 1 uur duurde. De resultaten geven aan dat blootstelling aan replicatiestress breukaccumulatie veroorzaakt, wat waarneembaar is door de AC-test.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de NC-test. (A) Het benodigde aantal cellen wordt de dag ervoor gezaaid in een schaaltje met 6 putjes. (B) Na medicamenteuze behandelingen worden de cellen getrypsiniseerd en geoogst in koude PBS. (C) De cellen worden voorzichtig geresuspendeerd in gesmolten agarose in een verhouding van 10:1 (10 μL agarose voor 1 μL celsuspensie) met behulp van een pipetpunt. (D) De celsuspensie wordt met behulp van een pipetpunt op een glaasje overgebracht en gelijkmatig verspreid om het putoppervlak volledig met agarose te bedekken. (E) Na incubatie bij 4 °C worden de objectglaasjes ondergedompeld in lysisbuffer, gevolgd door een koude 1x TAE-buffer. (F) De monsters worden onderworpen aan elektroforese met behulp van de juiste apparatuur. (G) De objectglaasjes worden vervolgens ondergedompeld in de DNA-precipitatieoplossing, gevolgd door een 70% ethanoloplossing. (H) Na droging worden de putjes gekleurd met 1x SYBR Green oplossing. (I) De objectglaasjes worden afgebeeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Figuur 2: Zijaanzicht van agarose op komeetglijbaanputten. (A) Na incubatie bij 4 °C (stap 3.8) verschijnt de gestolde agarose als een 'bel' met een bolle vorm. (B) Na droging bij 45 °C (stap 5.3) lijkt de agarose platgedrukt op de put. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Figuur 3: Beeldvorming en analyse van kometen. (A) Kometen binnen de binnenste cirkel van de put (blauw gemarkeerd) worden geselecteerd voor analyse. Kometen aan de buitenrand van de put worden uitgesloten vanwege atypisch langere staartmomenten, waardoor ze als uitschieters worden gemarkeerd. (B) Ten minste 100 representatieve kometen worden willekeurig geselecteerd uit het blauwgekleurde gebied. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Figuur 4: Representatief beeld van kometen verkregen uit de NC-test. Het rechterpaneel toont een representatief gezichtsveld voor SYBR Groengekleurde kernen, terwijl het linkerpaneel het gebied (groene omtrek) markeert dat wordt gebruikt voor het scoren van kometen. Kernen die gedeeltelijk zichtbaar zijn of dicht bij elkaar zijn gestapeld (rode omtrek, rechterpaneel) worden niet meegenomen in de analyse. Kometen die voor scoren zijn geselecteerd, moeten individueel te onderscheiden zijn, volledig binnen het gezichtsveld liggen en een uniforme kleuringsintensiteit vertonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Figuur 5: Representatief scoren van kometen verkregen uit de NC-test. (A) Individuele kernen worden geschetst met behulp van CometScore-software. (B) De weergave van het volledige spectrum (linkerpaneel) is ingeschakeld en de drempel (afkapbalk) is aangepast om een optimale signaalintensiteit te bereiken met minimale achtergrond. Het 'full spectrum'-signaal moet overeenkomen met het 'single hue'-beeld (bovenste afbeelding, rechterpaneel) en mag de omtrek niet overschrijden (onderste afbeelding, rechterpaneel). (C) De verticale gele lijn in het vak is uitgelijnd met het midden van de komeetkop, waarbij het breedste deel van de komeetkop wordt gebruikt als referentie voor consistentie. (D) De score voor elke geanalyseerde komeet wordt gerapporteerd in de rechterbovenhoek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Figuur 6: Analyse van pauze-inductie door replicatiestressreagentia. (A) U2OS-cellen werden behandeld met DMSO, 100 nM camptothecine (CPT) of 4 mM hydroxyureum (HU) vóór analyse van pauze-inductie. De representatieve grafiek toont een verhoogde accumulatie van breuken in cellen die zijn behandeld met CPT of HU. (B) Onbehandelde U2OS-cellen werden gezaaid op komeetglaasjes en geïncubeerd voor lysis (stap 3.9) bij kamertemperatuur (RT) of 4 °C om het effect van lysistemperatuur te vergelijken. Staartmomenten uit de analyses worden uitgezet als doos-en-snorharen grafieken met 10-90 percentielwaarden, waarbij mediaanwaarden worden weergegeven door horizontale lijnen binnen de vakken. P-waarden werden berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn (cutoff p-waarde van 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Figuur 7: Temporele analyse van door hydroxyureum geïnduceerde pauzes. U2OS-cellen waren onbehandeld of behandeld met 4 mM HU gedurende 4 uur of 8 uur vóór pauze-inductieanalyse. De representatieve grafiek toont een geleidelijke toename van de accumulatie van breuken in cellen die met HU worden behandeld. Staartmomenten uit de analyses worden uitgezet als doos-en-snorharen grafieken met 10-90 percentielwaarden, waarbij mediaanwaarden worden weergegeven door horizontale lijnen binnen de vakken. P-waarden werden berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn (cutoff p-waarde van 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Figuur 8: Dosisafhankelijke analyse van door camptothecine geïnduceerde pauzes. U2OS-cellen werden behandeld met DMSO of toenemende concentraties CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM en 1 μM) gedurende 1 uur vóór pauzeanalyse. Staartmomenten uit de analyses worden uitgezet als doos-en-snorharen grafieken met 10-90 percentielwaarden, waarbij mediaanwaarden worden weergegeven door horizontale lijnen binnen de vakken. De representatieve grafiek toont een dosisafhankelijke toename van pauzes geïnduceerd door CPT. P-waarden werden berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn (cutoff p-waarde van 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Figuur 9: Vergelijkende analyse van breuken in meerdere celtypen. hTERT-RPE-1-, HEK293T- en U2OS-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met DMSO of 1 μM CPT. De representatieve grafiek toont de relatieve omvang van DNA-schade over de drie celtypen in de aan- of afwezigheid van CPT. Staartmomenten uit de analyses worden uitgezet als doos-en-snorharendiagrammen met 10-90 percentielwaarden, waarbij mediaanwaarden worden weergegeven door horizontale lijnen binnen de vakken. P-waarden werden berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn (cutoff p-waarde van 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Figuur 10: Analyse van breukinductie door de AC-assay. U2OS-cellen werden behandeld met DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT of 10 μM PARP-remmer Olaparib voorafgaand aan de analyse van de pauze-inductie. Cellen werden gedurende 2 uur behandeld met DMSO, HU en PARP-remmer, terwijl CPT-behandeling gedurende 1 uur duurde. De representatieve grafiek toont een verhoogde accumulatie van breuken in cellen die zijn behandeld met CPT-, HU- of PARP-remmers. Staartmomenten uit de analyses worden uitgezet als doos-en-snorharen grafieken met 10-90 percentielwaarden, waarbij mediaanwaarden worden weergegeven door horizontale lijnen binnen de vakken. P-waarden werden berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn (cutoff p-waarde van 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Werkende oplossing</td>
		</tr><tr><td>Lysis Buffer</td>
			<td>0,5% SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x TAE-buffer</td>
			<td>40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA in pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>Oplossing voor DNA-precipitatie</td>
			<td>1 m ammoniumacetaat, 87% ethanol</td>
		</tr><tr><td>70% Ethanol oplossing</td>
			<td>70% Ethanol in gedestilleerd water</td>
		</tr><tr><td>1x SYBR Green oplossing</td>
			<td>1x SYBR Groen in 1x TAE buffer</td>
		</tr><tr><td>DMEM cultuur media</td>
			<td>DMEM met 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 cultuur media</td>
			<td>DMEM/F12 met 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Alkalische afwikkeloplossing (voor gebruik in Alkaline Comet Assay)</td>
			<td>200 mM NaOH, 1 mM EDTA in pH>13</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Lijst van buffers en oplossingen.

Dit protocol is ontworpen om de omvang van DNA-schade te onderzoeken die optreedt tijdens DNA-replicatie. Onder neutrale omstandigheden kan de inductie van DNA-breuken gemakkelijk binnen een kort tijdsbestek worden beoordeeld. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan andere celtypen en verschillende replicatiestressreagentia.

Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

De komeet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op het DNA in alle cellen met inbegrip van hippocampale neuronen. De methode maakt gebruik van de differentiële migratie van DNA in een elektrisch veld als gevolg van verschillen in hoeveelheid DNA schade.

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

We beschrijven hier een platform dat comet assay detectie van DNA-schade met ongekende doorvoer toestaat. De inrichting patronen zoogdiercellen in een microarray en maakt parallelle verwerking van 96 monsters. De benadering maakt analyse van basisniveau DNA schade, blootstelling DNA schade en DNA herstel kinetiek.

CometChip: Een High-throughput 96-Well Platform voor het meten van DNA-schade in Microarrayed menselijke cellen

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

Dit protocol beschrijft een effectieve methode voor het kwantificeren van het verschil in DNA-schade veroorzaakt door type I- en type II-remmers in FLT3-mutante cellen door de toepassing van de komeettest.

Komeettest om DNA-schade te kwantificeren in FLT3-cellen die mutant tot expressie brengen van 32D na blootstelling aan type I en type II FLT3-remmers

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

Tonen we de montage en de toepassing van een moleculaire schaal apparaat aangedreven door een topoisomerase eiwit. Het construct is een bio-moleculaire sensor die twee belangrijke soorten van DNA breuken in weefselcoupes labels door het aanbrengen van twee verschillende fluoroforen om hun doel.

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

Ontdek hoe de neutrale komeettest DNA-breuken detecteert in delende menselijke cellen tijdens replicatiestress. Deze methode onderzoekt de rol van SNF2L in DNA-synthese en genoomstabiliteit.

Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest

Meer video's verkennen