Name: Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Leer een innovatieve methode om tumorcelinvasie in 3D-culturen te analyseren met heterosferoïden. Deze techniek onderzoekt interacties tussen kankercellen en niet-neoplastische cellen in de tumoromgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de São Paulo Research Foundation (FAPESP 20/10544-1 en 20/10664-7). Sommige afbeeldingen zijn gegenereerd met behulp van BioRender.com.

Het gebruik van primaire menselijke cellen werd goedgekeurd door de Institutional Human Research Ethics Committee (CAAE 57895822.0.0000.5416) van de School of Dentistry in Araraquara - UNESP. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding van cellen voor 3D-celkweek
NOTITIE: Alle stappen in dit gedeelte moeten worden uitgevoerd binnen een lamellenvormige stromingskap.
<ol><li>Verkrijg eencellige suspensies van de cellen die de heterosferoïde zullen vormen. OPMERKING: In dit experiment hebben we sferoïden gegenereerd (zie stap 2) bestaande uit OSCC-cellijn (SCC9), fibroblasten (primaire kanker-geassocieerde fibroblast uit tongkankerbiopten) en monocyten (primaire monocyten van gezonde donoren). Selecteer het type cellen op basis van experimentele interesses.</li>
	<li>Controleer het celnummer en de levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer en trypan-blauwkleuring. OPMERKING: De celverhouding in dit protocol is 5:3:2 (5.000 neoplastische: 3.000 fibroblasten: 2.000 monocyten), in totaal 10.000 cellen per sferoïde. Optimaliseer de verhouding en het totale aantal cellen volgens experimentele interesses.</li>
	<li>Verdun cellen afzonderlijk in buisjes van 1,5 ml met een niet-aangevuld medium dat geschikt is voor elk celtype (bijv. voor neoplastische cellen - DMEM/F12; voor fibroblasten - DMEM; voor monocyten - RPMI) om een geschikte zaaidichtheid van 5.000 neoplastische cellen per putje, 3.000 fibroblasten per putje en 2.000 monocyten per putje of 500.000 cellen per milliliter te bereiken. OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat er voldoende cellen voor het experiment zijn, gebruikt u 20% meer dan het totaal dat nodig is, rekening houdend met mogelijke verliezen tijdens de kleurings- en centrifugatiestappen.</li>
	<li>Label de verschillende celtypen afzonderlijk met behulp van verschillende fluorescerende vitale kleuringen die gedurende meerdere generaties in levende cellen blijven. Voeg geoptimaliseerde concentraties fluorescerende kleurstof toe aan het medium dat cellen bevat (bijv. neoplastisch: CFSE - groene kleurstof; fibroblast: CMTPX - rode kleurstof; monocyt, violette BMQC - blauwe kleurstof) en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten. OPMERKING: Selecteer fluorescentiesondes met verschillende excitatie- en emissiespectra om spectrale overlapping te voorkomen volgens de specificaties van de confocale microscoop die zal worden gebruikt.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om een celpellet te vormen. Zuig het medium op met een pipet van 200 μl en suspendeer opnieuw in 1 ml 1x PBS.</li>
	<li>Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten om een celpellet te vormen en resuspendeer het totale aantal cellen in 1 ml gesupplementeerd kweekmedium volgens het gebruikte celtype/cellijn (bijv. neoplastisch - 100 μg/ml streptomycine, 100 IE/ml penicilline, 10% (vol) FBS en 400 μg/ml hydrocortison; fibroblast en monocyten - 100 μg/ml streptomycine, 100 IE/ml penicilline, 10% (vol) FBS). Controleer de fluorescentie-intensiteit op de microscoop en tel de cellen met trypanblauwe kleuring.</li>
</ol>2. 3D celcultuur
OPMERKING: Deze studie maakte gebruik van de bioprinting magnetische veldmethode11 om heterosferoïden te creëren. Hier worden cellen gemagnetiseerd met behulp van biocompatibele magnetische nanodeeltjes en onderworpen aan zachte magnetische krachten. Optimaliseer de verhouding tussen nanodeeltjes en cellen volgens het celtype. Alternatieve methoden voor het vaststellen van sferoïde culturen kunnen ook worden gebruikt. Voer de stappen in dit gedeelte uit in een laminaire stromingskap.
<ol><li>Voeg magnetische nanodeeltjes toe in een verhouding van 1 μL nanodeeltjes tot 20.000 cellen en voer grondig opnieuw in suspensie door 10 keer te mengen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g kamertemperatuur en meng ze 10 keer opnieuw. Herhaal deze cyclus van centrifugeren/resuspensie nog twee keer. OPMERKING: Gemagnetiseerde cellen vormen een bruinachtig gekleurde pellet.</li>
	<li>Na voltooiing van de laatste centrifugatiecyclus, zuigt u het medium op en suspendeert u de cellen opnieuw in 34 μl per putje (34 μl/5.000 neoplastische cellen; 34 μl/3.000 fibroblastcellen; 34 μl/2.000 monocytcellen) aangevuld kweekmedium (DMEM/F12 met 100 μg/ml streptomycine, 100 IE/ml penicilline en 5% (vol) FBS) voor de neoplastische cellen. OPMERKING: Bereken het volume op basis van de grootte van de put. Dit protocol maakte gebruik van platen met 96 putjes, in totaal 100 μL medium per putje.</li>
	<li>Meng alle cellen in een nieuwe buis voor co-culturing en suspendeer vervolgens opnieuw.</li>
	<li>Breng 100 μL co-gekweekte cellen over in elk putje van een ultralage bevestigingsplaat.</li>
	<li>Plaats het magnetische veld van de sferoïde aandrijving onder de plaat om aggregatie en sferoïde vorming te induceren en plaats het gedurende 3 uur in de incubator (5% CO2, 37 °C). OPMERKING: De tijd van blootstelling aan het magnetische veld kan variëren afhankelijk van de grootte of samenstelling van de sferoïde.</li>
	<li>Verwijder het magnetisch veld en plaats de plaat in de incubator (5% CO2, 37 °C) gedurende ten minste 24 uur om de productie van extracellulaire matrixeiwitten en cel-tot-cel/cel-tot-matrix-interacties mogelijk te maken.</li>
</ol>3. Bereiding van extracellulair matrix-gecoat microporeus membraan
NOTITIE: Voer de stappen in dit gedeelte uit in een lamellenbuiskap.
<ol><li>Voeg 50 μL van de in de handel verkrijgbare extracellulaire matrix toe aan het midden van een microporeus membraan met 24 putjes met behulp van een punt van 200 μL. NOTITIE: Bewaar de extracellulaire matrix op nat ijs. Raak het microporeuze membraan niet aan wanneer u de matrix erop plaatst.</li>
	<li>Verwijder luchtbellen met een steriele naald en zorg ervoor dat de matrix het hele membraanoppervlak bedekt.</li>
	<li>Plaats het membraan gedurende 1 uur in de incubator (37 °C) om gelvorming van de extracellulaire matrix mogelijk te maken.</li>
</ol>4. Invasie test
NOTITIE: Voer de stappen in dit gedeelte uit in een lamellenbuiskap.
<ol><li>Voeg 500 μL DMEM/F12-kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum toe aan de onderste kamer van het microporeuze membraan als chemo-lokstof.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het medium van de gevormde sferoïden en voeg voorzichtig 50 μl/putje vers, niet-aangevuld DMEM/F12-medium toe aan het heterosferoïde. OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van een vasthoudschijf voor de bioprinting-methode met magnetische velden.</li>
	<li>Knip de rand van een 200 μL lage retentiepunt af met een steriele schaar. OPMERKING: De grootte van de punt is afhankelijk van de grootte van de sferoïde.</li>
	<li>Verzamel de sferoïde en 50 μL medium met de tip voor lage retentie. NOTITIE: Voer deze stap langzaam en voorzichtig uit om desaggregatie van de sferoïde te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de sferoïde voorzichtig op de extracellulaire matrix. NOTITIE: Raak de gelei-extracellulaire matrix niet aan.</li>
	<li>Voeg voorzichtig druppel voor druppel 150 μL niet-aangevuld DMEM/F12 medium toe om een totaal volume van 200 μL te bereiken.</li>
	<li>Plaats de plaat 48 uur in de incubator (5% CO2, 37 °C). OPMERKING: De incubatietijd kan variëren, afhankelijk van de cellijn of het protocol.</li>
</ol>5. Acquisitie van afbeeldingen
<ol><li>Gebruik een confocale microscoop voor beeldvorming.</li>
	<li>Stel de microscoop in op basis van de excitatie- en emissiekenmerken van vitale fluorescerende kleuringen die worden gebruikt (bijv. CFSE-kleurstof, 488 nm laser en 520 nm detectiegolflengte; fibroblast: CMTPX-kleurstof, 561 nm laser en 610 nm detectiegolflengte; monocyt, violette BMQC-kleurstof, 405 nm laser en 516 nm detectiegolflengte).</li>
	<li>Plaats de plaat op de microscooptafel.</li>
	<li>Lokaliseer sferoïden/cellen met behulp van het heldere veld met een vergroting van 10x.</li>
	<li>Pas de zoom aan tot 40x vergroting.</li>
	<li>Stel het laservermogen en de detectorversterking in voor elk fluorescerend kanaal.</li>
	<li>Identificeer het startpunt van de Z-Stack als het brandpuntsvlak van het membraan door de membraanporiën te lokaliseren met behulp van het heldere veld.</li>
	<li>Leg drie beelden onder en vijf tot acht beelden boven het membraan vast langs de z-as voor elk kanaal, inclusief het heldere veld. Zorg voor intervallen van 10 μm tussen de beelden, met een totale diepte van 90-120 μm in de z-as.</li>
	<li>Sla het project op als een .czi-extensiebestand nadat u de afbeeldingen hebt gegenereerd.</li>
</ol>6. Extractie van afbeeldingen
OPMERKING: Het gebruik van afbeeldingssoftware wordt hieronder uitgelegd.
<ol><li>Open het .czi-bestand met behulp van de beeldbewerkingssoftware (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Klik op Verwerking in de rechterbovenhoek en selecteer vervolgens Enkel. Klik vervolgens op Methode en kies Afbeelding exporteren.</li>
	<li>Selecteer het bestand onder Invoer.</li>
	<li>Klik op de knop Parameters en selecteer vervolgens de volgende instellingen: Bestandstype (Tagged Image File Format - . TIFF), Compressie (LZM), Formaat wijzigen (100%), Weergavecurve en kanaalkleur toepassen, Individuele kanaalafbeeldingen, Kanaalnamen gebruiken, Subsets definiëren (Kanaal, alle kanalen selecteren), Z-positie (alles extraheren), Regio ( Volledig), Tegels (Geselecteerde tegels exporteren) en Exporteren naar (selecteer het bestand van bestemming). OPMERKING: Selecteer de volgende instellingen om samengevoegde kanaalafbeeldingen te extraheren: Bestandstype (Tagged Image File Format - . TIFF), Compressie (LZM), Formaat wijzigen (100%), Weergavecurve en kanaalkleur toepassen, Samengevoegde kanalenafbeelding, Kanaalnamen gebruiken, Subsets definiëren (Kanaal, selecteer de specifieke kanalen die u wilt overlappen), Z-positie (alles extraheren), Regio (Volledig ), Tegels (Geselecteerde tegels exporteren) en Exporteren naar (selecteer het bestand van bestemming).</li>
	<li>Klik op het pictogram Toepassen in de rechterbovenhoek. OPMERKING: Met deze stap worden tegelijkertijd afbeeldingen van de verschillende kanalen geëxporteerd.</li>
</ol>7. Analyse van het beeld
OPMERKING: Het gebruik van gratis software wordt in deze stap uitgelegd.
<ol><li>Klik op Bestand in de linkerbovenhoek, selecteer Openen, kies de afbeelding en klik vervolgens op OK.</li>
	<li>Klik op Analyseren, vervolgens op Metingen instellen en selecteer Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Weergavelabel. Klik op OK.</li>
	<li>Klik op Analyseren en vervolgens op Meten. OPMERKING: Zorg ervoor dat het gebied van alle afbeeldingen hetzelfde is. "Integrated Density" geeft twee waarden weer: (1) Raw Integrated Density (RawIntDen): som van alle pixelwaarden in de afbeelding; (2) Geïntegreerde dichtheid (IntDen): Product van gemiddelde grijswaarde en oppervlakte. Aangezien de afbeelding RGB-kleur is en het gebied van alle afbeeldingen hetzelfde is, kunt u overwegen RawIntDen te gebruiken als de fluorescentiemeetwaarde. Verschillen in fluorescentiewaarden (intensiteit en kwantiteit) tussen afbeeldingen kunnen duiden op variaties in celinvasie en proliferatie-intensiteit. Een andere methode om het invasiepatroon in de extracellulaire matrix naar het microporeuze membraan te normaliseren met behulp van co-culturen van verschillende celtypen, is het berekenen van de verhouding van RawIntDen-waarden: Verhouding RawIntDen =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67114/67114eq01.jpg" style="margin: auto;"> Een verhouding van 1 vertegenwoordigt het beeld/de locatie langs de z-as met de hoogste invasie/lokalisatie van cellen voor dat specifieke celtype.</li>
</ol>

3D-modellen in de kankerbiologie: invasiedynamiek in heterosferoïden

<ol><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+Mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+Plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+automatic+monitoring+of+cancer+cell+invasion+into+an+epithelial+monolayer+using+label-free+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+A+comparison+of+different%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - A comparison of different.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).</li>
<li>Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+cultures%3A+Evolution+of+an+ancient+tool+for+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications.</a> Front Physiol. 13, 1-15 (2022).</li>
<li>Trindade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+3D+cell+culture+State+of+the+art+and+current+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances.</a> Life Sci. 286, 1-8 (2021).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. (160), e61392(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Driedimensionale sferoïde culturen zijn een krachtige benadering om verschillende aspecten van de celbiologie te onderzoeken. In deze studie rapporteren we een protocol voor het evalueren van neoplastische celinvasie met behulp van heterosferoïden die de micro-omgeving van de tumor nabootsen in een meerlagige en meer dynamische benadering. Deze methode maakt de beoordeling van co-lokalisatie en invasiepatronen mogelijk in aanwezigheid van niet-neoplastische stromale cellen.
Er zijn enkele cruc...

Invasie is een proces waarbij neoplastische cellen door de extracellulaire matrix migreren naar het omringende weefsel 1,2. Naarmate de tumor vordert, worden neoplastische cellen blootgesteld aan steeds complexere micro-omgevingen. De micro-omgeving van de tumor omvat verschillende componenten van de extracellulaire matrix en niet-neoplastische celtypen. Stromale cellen, waaronder fibroblasten en residente macrofagen, hermodelleren de micro-omgeving door extracellulaire matrixcomponenten en groeifactoren en cytokines af te scheiden, die op hun beurt de neoplastische celfuncties beïnvloeden3. Stromale en infiltrerende leukocytencellen interageren ook rechtstreeks met neoplastische cellen, met elkaar en met de extracellulaire matrix in een driedimensionale micro-omgeving. Al met al beïnvloedt de TME-samenstelling de werkzaamheid en het patroon van neoplastische celinvasie4.
De ingewikkelde aard van de micro-omgeving van de tumor vereist de implementatie van effectieve methodologieën voor het begrijpen van intercellulaire interacties in tumorweefsel. De meeste in-vitrotests die worden gebruikt om invasie te beoordelen, zijn voornamelijk uitgevoerd in traditionele 2D-modellen en/of culturen van het type enkele cel 5,6,7,8, wat het complexe proces van invasie te eenvoudig maakt en meerdere beperkingen heeft, zoals het ontbreken van weefselarchitectuur, stromale componenten en in vivo reproduceerbaarheid. Sferoïde culturen vertegenwoordigen een model van in vitro 3D-culturen dat de morfologie van de tumormassa nabootst, waardoor cel-cel- en cel-matrixinteracties met fysische en biochemische kenmerken mogelijk zijn9. Het gebruik van 3D-kweekmodellen is de afgelopen decennia gegroeid en er zijn aanwijzingen dat verschillende biologische uitkomsten, zoals respons op behandeling, celmorfologie en genexpressie, anders zijn in vergelijking met het 2D-model 9,10.
Dit protocol demonstreert een methode voor het beoordelen van in vitro invasie in een menselijke extracellulaire matrix met behulp van 3D-sferoïde celcultuur. Bovendien gebruikten we heterosferoïden bestaande uit neoplastische cellen, fibroblasten en monocyten om de micro-omgeving van de tumor na te bootsen met twee relevante niet-neoplastische celtypen. De beeldvorming van cellen door confocale microscopie langs verschillende invasievlakken in de richting van een microporeus membraan maakt het mogelijk om dit proces te visualiseren in een meer dynamische en gelaagde context.

<table><tbody><tr><td>96 Well Bioprinting Kit</td><td>Greiner Bio-one</td><td>&nbsp;655840</td><td>Spheroid drive magnetisch veld. Holding drive. 96 well microplate, cel-afstotende oppervlakte</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Violet BMQC Dye</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>C10094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Extracellulaire matrix met Myogel</td><td>doi: 10.1186/s12885-015-1944-z</td><td></td><td>Mix samengesteld uit myogel (2,4 mg/mL), collageen (0,8 mg/mL) en niet-gesupplementeerd medium van neoplastische cel&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Nanoshuttle-PL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657841</td><td>Magnetische nanodeeltjes</td></tr><tr><td>Naald 23 G</td><td>Medix</td><td>AHMD004</td><td>25 x 0,60 mm (23 G x 1)</td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>2012-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (5.000 U/mL)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen, Corning Inc.</td><td>TF-200-L-R-S</td><td>Pipettip met barrière (filter), 200 &micro;L Low Retention Filter, kort, maximale terugwinning</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>TransWell 24 well</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>3422</td><td>Transwell Permeable Supports 6,5 mm Insert, 24 well plaat; 0,8 &micro;m Polycarbonaat Membraan</td></tr><tr><td>Zen 3.4 (blue edition)</td><td>Zeiss Group</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3d-culturen te analyseren

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Sferoïde cultuur is een 3D-model dat een verbeterde replicatie van de in vivo micro-omgeving biedt in vergelijking met traditionele tweedimensionale (2D) culturen. Invasie is een cellulair resultaat dat van het grootste belang is in de biologie van kanker. In dit protocol hebben we een alternatieve strategie bedacht voor het evalueren van invasie van kankercellen in vitro, waarbij gebruik wordt gemaakt van heterosferoïden bestaande uit oraal plaveiselcelcarcinoom (OSCC), kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) en monocyten. Deze heterosferoïden zijn bedoeld om de micro-omgeving van de tumor (TME) na te bootsen, inclusief twee relevante niet-neoplastische celtypen naast de kankercellen. Elk celtype werd gelabeld met vitale fluorescerende markers die in verschillende golflengten uitzonden voordat ze sferoïde werden gevormd. Eenmaal gevormd, werden heterosferoïden gezaaid op een laag van menselijke leiomyoom-afgeleide extracellulaire matrix in het bovenste compartiment van een microporeus membraan. Invasie werd beoordeeld in de z-as met behulp van confocale microscopie. Digitale beelden werden verkregen in de overeenkomstige fluorescentiekanalen met tussenpozen van 10 μm, met een diepte van 90 μm in de z-as. De analyse werd uitgevoerd met behulp van freeware beeldsoftware door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit in elk beeld en fluorescentiekanaal te berekenen. Deze benadering maakt een meer dynamische analyse van celinvasiepatronen in een meerlagige context mogelijk, evenals het onderzoek van ruimtelijke co-lokalisatie van verschillende celtypen tijdens invasie.

Deze studie presenteert een alternatieve methode voor het beoordelen van celinvasie in vitro met behulp van sferoïden die zijn samengesteld uit verschillende celtypen. Het maakt de analyse van celinvasiepatronen in een meerlagige context en het onderzoek van de co-lokalisatiedynamiek van cellen tijdens invasie mogelijk (Figuur 1).
De heldere-veldbeelden vertegenwoordigen de lokalisatie van sferoïden/cellen, geïdentificeerd door donkere/zwarte agglomeraten...

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

alternative-strategy-to-analyze-in-vitro-cell-invasion-of-3d-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

This video describes the technique of utilizing a native matrix to study tumor cell invasion. The technique used in this assay provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix.

Tumor Cell Invasion Assay: A 3D In Vitro Native Matrix-based Method to Assess Epithelial-mesenchymal Cell Interactions

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Dit videoartikel beschrijft een gewijzigde in vitro methode om de rol van hormonen, cytokinen en/of groeifactoren bij het aanjagen van kankercelinvasie te onderzoeken.

Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Leer een innovatieve methode om tumorcelinvasie in 3D-culturen te analyseren met heterosferoïden. Deze techniek onderzoekt interacties tussen kankercellen en niet-neoplastische cellen in de tumoromgeving.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Meer video's verkennen