Een uitgebreide pijplijn om de efficiëntie van menselijke erytropoëse in vitro en ex vivo te beoordelen
10 januari 2025
Het modelleren van erytropoëse biedt een waardevolle kans om de biologische betekenis van actoren in dit proces te begrijpen en om nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren die differentiatiedefecten kunnen verlichten. Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode om CD34+ hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo efficiënt te differentiëren.
Ons onderzoek richt zich op leukemie, met name myelodysplastische syndromen of myelodysplastische neoplasie. Het is een stamcelziekte die afkomstig is van hematopoëtische stamcellen. Het beïnvloedt verschillende bloedcellijnen, met name de erytroïde afstamming, die verantwoordelijk is voor de productie van hartbloedcellen.
Verstoring van deze afstamming kan leiden tot bloedarmoede, die vaak wordt gezien bij MDS-patiënten. De pijplijn die we in dit artikel bieden, maakt een robuuste en vereenvoudigde methode mogelijk om de efficiëntie van menselijke erytroblasten in vitro te beoordelen bij genmodificatie of medicamenteuze behandeling. Hematopoëtische stamcellen zijn aanwezig vanaf de geboorte tot het laatste moment van ons leven.
Er is geen proliferatief weefsel meer in ons organisme met biljoenen cellen die elke dag worden geproduceerd. Er zijn nog zoveel dingen om te begrijpen, dus we zullen deze verbazingwekkende cellen blijven bestuderen in gezonde aminoweefsels met een sterke nadruk op proteostase en RNA-biologie. Ontdooi om te beginnen 100.000 CD34+UCB-cellen door de injectieflacon gedurende 30 seconden onder te dompelen in een waterbad dat is ingesteld op 37 graden Celsius.
Voeg druppelsgewijs een milliliter ontdooimedium toe aan de injectieflacon en suspendeer de cellen vervolgens voorzichtig door op en neer te pipetteren. Breng de geresuspendeerde celsuspensie druppel voor druppel over in vijf milliliter ontdooimedium. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur.
Was de cellen in 10 milliliter fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS-buffer met DNAse. Nadat u de cellen opnieuw hebt gecentrifugeerd, suspendeert u de pellet opnieuw in twee milliliter stimulatiemedia. Breng twee milliliter celsuspensie over in een plaat met 24 putjes en incubeer de plaat gedurende vier tot zes uur bij 37 graden Celsius.
Verzamel vervolgens de cellen in fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuizen en vul ze aan met een milliliter stamcelmedium. Voeg na het ontdooien van het virus het vereiste volume toe aan stimulatiemedia om een infectieveelvoud van 30 te bereiken. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in virusbevattende media met een dichtheid van 100.000 cellen per 100 microliter virus en breng ze over in een putje van een plaat met 96 putjes.
Voeg PBS toe aan de lege putten en broed een nacht bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens het volledige volume celsuspensie uit het putje van de plaat met 96 putjes over in FACS-buisjes met één milliliter stamcelmedium. Was het putje en de pipetpunt met stamcelmedium om twee milliliter stamcelmedium toe te voegen aan de FACS-buis.
Na het centrifugeren van de FACS-buis, gooit u het bovenstaande weg en resuspendeert u de celpellet in twee milliliter expansiemedia. Breng de suspensie over in een putje van een plaat met 24 putjes en incubeer de cellen. Breng om te beginnen het volledige volume CD34+-cellen dat met de EGFP-reporter is getransduceerd over naar een aparte FACS-buis.
Centrifugeer gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 100 microliter FACS-buffer. Voeg vijf microliter CD34-antilichaam per buisje toe en incubeer de buisjes 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius.
Resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter FACS-buffer met DAPI en centrifugeer gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur. Nadat de cellen zijn geresuspendeerd in 200 microliter FACS-buffer die DAPI bevat, filtert u de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer voordat u gaat sorteren. Voeg vervolgens 0,5 microliter CD34-antilichaam toe aan één druppel kralen in 100 microliter PBS.
Incubeer het mengsel in het donker bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe aan het mengsel. Centrifugeer gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur.
Gooi het bovenstaande weg en resuspendeer de pellet in 500 microliter PBS. Voeg vervolgens GFP-negatieve en GFP-positieve leukemiecellen toe aan een FACS-buisje. Was de cellen in een milliliter FACS-buffer.
Resuspendeer na het centrifugeren van de cellen 100.000 GFP-negatieve cellen en 100.000 GFP-positieve cellen, elk in 500 microliter FACS-buffer. Filtreer de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer voordat u deze sorteert. Verzamel vervolgens de gesorteerde cellen in stamcelmedium.
Centrifugeer de cellen gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur. Resuspendeer vervolgens de cellen in drie milliliter erytroïde differentiatiemedia. Doseer nu een milliliter van de geresuspendeerde cellen in drie putjes van een plaat met 24 putjes.
Vul alle buitenste kuiltjes met PBS. Om de media te verversen, zorgt u ervoor dat de cellen zich op de bodem van de plaat hebben genesteld. Leun voorzichtig op de plaat en verwijder 500 microliter media.
Voeg vervolgens 500 microliter 2X cytokine erytroïde differentiatiemedia toe om de plaat op te frissen. Breng op dag zes de cellen over naar een plaat met 12 putjes en voeg een milliliter media toe aan elk putje om een eindvolume van twee milliliter te bereiken. Verzamel 200 microliter cellen uit elk putje van de plaat met 12 putjes.
Vervang het verwijderde volume door 250 microliter 2X erytroïde differentiatiemedia. Voeg een milliliter FACS-buffer toe aan elke opvangbuis. Na het centrifugeren van de buizen suspenderen de gepelleteerde cellen in 100 microliter FACS-buffer.
Voeg elk een microliter CD71-, CD34- en CD235a-antilichamen toe aan de buisjes. Resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter FACS-buffer die DAPI bevat. Centrifugeer de buisjes gedurende acht minuten bij 320 G bij kamertemperatuur.
Resuspendeer de cellen in 200 microliter FACS-buffer met DAPI. Stel DAPI in op basis van side scatter of SSC om dode cellen uit te sluiten. Stel de SSC-hoogte versus het SSC-gebied in om aggregaten uit te sluiten en selecteer afzonderlijke cellen.
Stel het voorwaartse verspreidingsgebied in ten opzichte van SSCA om puin te verwijderen op basis van de grootte. Set CD235a versus CD71. Set CD34 versus SSCA.
Run kralen, GFP-positieve cellen en DAPI-gekleurde cellen. Compenseer de meetwaarden en pas de compensatie toe op de instellingen van de cytometer. CD34-positieve cellen uit navelstrengbloed vertoonden een toename van Annexine V-positieve apoptotische cellen van 14,4% op dag vier tot 34,2% op dag 17.
Het staafdiagram toont een significante toename van het percentage Annexin V-positieve cellen op dag 17, tot ongeveer 40%
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de ex vivo differentiatie van CD34+ hematopoëtische stam- en progenitorcellen, waarbij wordt ingegaan op de kritieke processen die betrokken zijn bij erythropoëse en de implicaties hiervan voor de behandeling van aanverwante aandoeningen zoals myelodysplastische syndromen. Door een vereenvoudigde methode te bieden om de efficiëntie van erythroblasten te evalueren, beoogt het onderzoek het begrip te vergroten van de verstoringen die leiden tot anemie bij deze patiënten.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Erytropoëse
- Myelodysplastische syndromen
- Hematopoëtische stamcelbiologie
Achtergrond
- Myelodysplastische syndromen zijn stamcelziekten die de bloedcellijnen beïnvloeden.
- Verstoring van de erytroïde lijn kan leiden tot anemie.
- Het begrijpen van hematopoëtische stamcellen is cruciaal, aangezien deze gedurende het hele menselijke leven aanwezig blijven.
Gebruikte methoden
- Ontdooien en resuspenderen van CD34+ UCB-cellen
- Celtransductie met genmodificaties
- Fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS)
Belangrijkste resultaten
- CD34+ cellen vertoonden na verloop van tijd verhoogde apoptosesnelheden.
- Een efficiënte differentiatie naar erythroblasten werd aangetoond.
- De ontwikkelde specifieke methoden maken beoordeling mogelijk na genmodificatie of medicamenteuze behandeling.
Conclusies
- De studie demonstreert een robuuste methode voor het differentiëren van hematopoëtische cellen, wat kan leiden tot effectievere behandelingen voor anemie veroorzaakt door myelodysplastische syndromen.
- Dit werk onderstreept het belang van het begrijpen van celdifferentiatie binnen de stamcelbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Een efficiënte beoordeling van de menselijke erythropoëse is essentieel om risico's in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling voor hematologie te beperken en om de mechanismen ten grondslag aan anemie en myelodysplastische syndromen te begrijpen. Deze pijplijn maakt een robuuste, kwantitatieve evaluatie van erytroïde differentiatie en genfunctie mogelijk in zowel gezonde als ziekte-relevante menselijke systemen. De aanpak ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie en informeert portfoliobeslissingen voor therapieën die de erythropoëse moduleren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om de genfunctie en de impact van signaalpaden op de commitment van de erytroïde lijn te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoanalyse door de effecten van genetische verstoringen of verbindingen op de erytropoëse te kwantificeren.
- Faciliteert functionele validatie van targets in primaire menselijke hematopoëtische stam- en progenitorcellen.
- Biedt mechanistisch inzicht in ziekte-relevante verstoringen, zoals die worden gezien bij myelodysplastische syndromen.
Screening & assayontwikkeling
- Vestigt gevalideerde in vitro- en ex vivo-systemen voor het screenen van verbindingen die de erythroïde differentiatie beïnvloeden.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve read-outs mogelijk met behulp van flowcytometrie en marker-gebaseerde celidentificatie.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays voor vergelijkbaarheid tussen verschillende studies en teams.
- Bereidt schaalbare platforms voor om genmodulatie en drug rescue-strategieën te evalueren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro-bevindingen met ex vivo patiëntafgeleide modellen voor translationele continuïteit.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten mogelijk met aangetoonde effecten op erythropoëse.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers door differentiatie- en apoptosemarkers over verschillende tijdspunten te volgen.
- Biedt mechanische risicoreductie voor de selectie van preklinische kandidaten in hematologieportfolio's.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert het proces van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie in hematologie-georiënteerde pipelines.
- Discovery Biology: Kwantificeert de effecten van genen en verbindingen op de specificatie en rijping van de erythroïde lijn.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare assays op basis van flowcytometrie voor genetische screening en screening van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve output, zoals apoptosepercentages en markerexpressie, voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro en ex vivo bevindingen en patiëntrelevante ziektemodellen.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Biedt een modulaire, herbruikbare workflow die aanpasbaar is aan diverse gentargets en verbindingenbibliotheken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie en het mechanistische begrip van erythropoëse.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid binnen R&D-teams.
- Strategische waarde: Maakt onderbouwde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen hematologieprogramma's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets en verbindingen met gevalideerde erythroïde effecten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de kweek van hematopoëtische stamcellen en flowcytometrie-analyse.
- Toegang tot FACS-instrumentatie en gevalideerde antilichaampanels voor erytroïde markers is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van gating-strategieën en data-interpretatie tussen teams.
- Aanpasbaar voor zowel gezonde donoren als patiëntafgeleide monsters voor een bredere toepasbaarheid.
- Afhankelijk van robuuste celbronnen en kwaliteitscontrole voor reproduceerbare resultaten.
