U-vormige horizontale zwemtechniek voor het bereiden van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index

[Verteller] Het onderzoek richt zich op een methode voor sperma-optimalisatie, met als doel te bepalen of de UHS-techniek voordelen biedt bij het bereiden van sperma van hoge kwaliteit met een lage DNA-fragmentatie-index. Microfluïdische technologie is gebruikt om de selectie van sperma van hoge kwaliteit met een lagere DFI te optimaliseren. De belangrijkste beperking van de UHS-methode is de hoge afhankelijkheid van het zelfzwemmende vermogen van sperma van hoge kwaliteit. De UHS-methode is niet geschikt voor patiënten met volledig immobiel sperma. Thigmotaxis speelt een cruciale rol bij de scheiding van sperma. De U-vormige baan heeft een langere begrenzing, die de vrije beweging van sperma van hoge kwaliteit vergemakkelijkt, waardoor ze volledig kunnen worden gescheiden van immobiel sperma, onzuiverheden en andere componenten. Vergeleken met de DGC-techniek omvat de UHS-lane-methode minder handmatige bedieningsstappen voor laboratoriumpersoneel en ondergaat sperma van hoge kwaliteit dat via de UHS-lane-methode is verkregen, geen herhaalde centrifugatieprocedures, wat resulteert in een lagere DFI. Voeg om te beginnen 20 microliter bemestingsmedium toe aan de operatieschaal om U-vormige sporen te maken. Zuig met een pipet 10 microliter bemestingsmedium op om een cirkelvormige druppel te creëren op het linker startpunt van de U-vormige baan. Maak met behulp van het bemestingsmedium twee bufferdruppels van elk 10 microliter met tussenpozen langs het linker middengedeelte van de U-vormige baan. Verbind alle druppels met bemestingsmedium om een doorlopende baan te vormen. Gebruik 2,5 microliter polyvinylpyrrolidon, of PVP, om een lange strook vloeistofdruppel aan de rechterkant van de U-vormige baan te maken. Maak zes microdruppels met behulp van het eicelverwerkingsmedium aan de rechterkant van de PVP-strip. Voeg zeven milliliter kweekolie toe aan de schaal en zorg ervoor dat de olie het hoogste punt van de druppels volledig bedekt. Zet de schaal een nacht in een incubator van 37 graden Celsius met 6% kooldioxide om in evenwicht te komen. Meet na het verzamelen van het sperma het volume met behulp van de weegmethode, waarbij u een nauwkeurigheid tot op 0,01 milliliter garandeert. Plaats het spermamonster gedurende 15 tot 30 minuten in een omgeving van 37 graden Celsius en zuig het op in een plastic wegwerppipet met brede boring. Als het sperma niet binnen 60 minuten vloeibaar wordt, voeg dan een gelijke hoeveelheid bevruchtingsmedium toe. Adem het mengsel herhaaldelijk in en uit met behulp van een plastic wegwerppipet totdat het volledig vloeibaar wordt. Meet de pH-waarde van het sperma met behulp van precisie-pH-testpapier met een bereik van zes tot 10. Neem 10 microliter volledig vloeibaar sperma en druppel het op een maculaire telkamer. Evalueer de beweeglijkheid van het sperma onder een veld van 200x met behulp van een optische microscoop. Voeg vijf microliter sperma toe aan de microdruppel van het bevruchtingsmedium aan het linker beginpunt van de U-vormige baan in de ICSI-operatieschaal. Pas de hoek en positie van de eicelvasthoudende naald en injectienaald onder de 4X objectieflens aan. Nadat u de opstelling hebt gecontroleerd, brengt u de geselecteerde eicel over naar de microdruppel van het eicelverwerkingsmedium in de ICSI-operatieschaal. Plaats het operatieschaaltje met de eicellen op het hete podium van de voorbereide microscoopoperator. Laat na het afstellen van de scherpstelling de injectienaald in de PVP-strip van de ICSI-operatieschotel zakken. Beweeg de injectienaald in de lange strook aan de rechterkant van de U-vormige baan en extraheer spermatozoa van hoge kwaliteit. Breng het sperma over in de PVP-strip aan de rechterkant en plaats het sperma op de bodem van de operatieschaal. Druk voorzichtig op de injectienaald in het middelste of onderste gedeelte van de spermastaart. Trek de injectienaald snel terug en krab aan het sperma om het te immobiliseren. Adem nu het sperma van de staart tot het hoofd in de injectienaald in. Injecteer langzaam sperma in het cytoplasma van de eicel en incubeer de geïnjecteerde eicel. Voeg 1,5 milliliter centrifugatieoplossing met een gradiënt van 45% dichtheid toe aan een steriele reageerbuis met conische bodem van 15 milliliter. En voeg langzaam 1,5 milliliter centrifugatieoplossing met 90% dichtheidsgradiënt toe aan de bodem van de 45% gradiëntoplossing. Voeg nu het vloeibare sperma toe aan de gradiëntcentrifugatieoplossing en draai de buis gedurende 15 minuten op kamertemperatuur op 300 G. Verzamel na het verwijderen van het bovenstaande ongeveer 0,5 milliliter van het resterende spermasediment en meng het met drie milliliter bevruchtingsmedium. Centrifugeer het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 200 G. Piket voorzichtig het supernatant uit, laat ongeveer 0,2 milliliter sediment over, schud en meng om het sediment opnieuw te suspenderen. Tel ten slotte de spermaconcentratie en beweeglijkheid voordat u het monster bewaart in een incubator van 37 graden Celsius, 6% kooldioxide voor later gebruik. Plaats een buis met 25 microliter agarose-oplossing met een laag smeltpunt gedurende één tot twee minuten in een waterbad van 90 tot 100 graden Celsius. Breng de buis vervolgens vijf minuten over naar een waterbad van 37 graden Celsius totdat de temperatuur stabiliseert. Voeg drie tot 10 microliter sperma toe aan agarosebuisjes met een laag smeltpunt en meng grondig. Laat 30 microliter van het mengsel in horizontale positie op een voorbehandelde glasplaat vallen. Plaats de voorbehandelde glasplaat na het afdekken gedurende vier minuten in een koelkast bij twee tot acht graden Celsius en zorg ervoor dat deze in een horizontale positie blijft. Haal de schuif uit de koelkast en schuif voorzichtig van het afdekglas. Dompel de voorbehandelde glasplaat snel zeven minuten onder in denatureringsoplossing. Verwijder de schuif en laat hem rechtop staan. Gebruik vervolgens filterpapier om overtollige waterdruppels te absorberen zonder het gebied van het monster aan te raken. Was de glijbaan vijf seconden in gedestilleerd water. Dompel de glasdia serieel onder in de juiste oplossingen voor de specifieke periode. Houd vervolgens het voorbehandelde glasplaatje horizontaal en voeg ongeveer een milliliter van de gemengde kleurstofoplossing toe aan het objectglaasje. Spoel na vijf minuten vlekken de glas-in-loodplaat 10 tot 15 keer voorzichtig af met gedestilleerd water. Sperma van hoge kwaliteit met een goede progressieve beweeglijkheid zwom soepel langs de rand van de U-vormige baan, waardoor het voor de intracytoplasmatische sperma-injectienaald gemakkelijker werd om ze afzonderlijk vast te pakken. Hoewel met beide methoden goede spermacellen werden verkregen, was de DNA-fragmentatie-index van sperma van hoge kwaliteit gescheiden met behulp van de dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode significant hoger in vergelijking met de U-vormige horizontale zwemmethode.