In vivo visualisatie van calciumtransiënten tijdens bevruchting en vroege ontwikkeling in C. elegans

De productie van levensvatbare embryo's is een complex proces. Ons algemene doel is om de cellulaire signalen te definiëren die de overgang van een eicel naar een embryo coördineren. De CaFE-reporter is een nieuw hulpmiddel dat is ontwikkeld om calciumsignalen te visualiseren die optreden bij de bevruchting en tijdens de vroege embryogenese.

Met behulp van de CaFE-reporter hebben we een vertraagde calciumgolf ontdekt in eicellen die voortijdig ovuleren. We hebben ook de aanwezigheid van eencellige calciumtransiënten ontdekt tijdens de vroege embryogenese. Beide bevindingen illustreren het nut van een genetisch gecodeerde calciumindicator tijdens de vroege ontwikkeling.

Eerdere technieken om calciumeicellen te visualiseren waren gebaseerd op kleurstofinjectie in de geslachtsklieren. Deze techniek is arbeidsintensief en vereist gespecialiseerde micro-injectieapparatuur. De CaFE-reporter maakt het mogelijk om de calciumgolf in eicellen en embryo's eenvoudig te visualiseren met algemeen verkrijgbare apparatuur.

De CaFE Reporter faciliteert onderzoek naar de timing en regulatie van calciumsignalering in eicellen en embryo's. Deze reporter kan gemakkelijk worden gecombineerd met bestaande mutanten, markers en RNAi-knockdowns om het gedrag van calcium bloot te leggen ten opzichte van andere belangrijke gebeurtenissen tijdens de vroege embryogenese, zoals myotische rijping. Houd om te beginnen het handvat van de wormpluier vast en maak de zilveren kraag los naar de kop zodat de vier secties uit elkaar vallen.

Plaats een 1,5-inch platinadraad in het midden van de vier secties. Houd de draad in het midden vast terwijl u de kraag aanspant om de vier secties bij elkaar te brengen. Gebruik een platbektang om de draad voorzichtig vorm te geven en klem herhaaldelijk het uiteinde van de draad vast om ongeveer een voet van twee tot drie millimeter te creëren.

Gebruik deze voet om de wormen op te pakken. Bereid een oplossing van 3%agarose in water en verwarm het in een magnetron tot agarose volledig is opgelost. Plaats een leeg microscoopglaasje tussen twee andere microscoopglaasjes met een enkele laag laboratoriumtape over de lange as.

Laat met behulp van een pipet van één milliliter de verwarmde 3%-agarose-oplossing op het midden van het lege glaasje vallen. Plaats snel een nieuw microscoopglaasje op de agarosedruppel, loodrecht op het lege objectglaasje, met de druppel op de aangrenzende afgeplakte objectglaasjes, en scheid de objectglaasjes vervolgens voorzichtig, waarbij het kussentje intact blijft. Voeg met behulp van een pipet van 20 microliter een kleine druppel levamisol van één millimolair in M9-buffer toe aan het midden van het agarosekussen om de wormen te verlammen.

Pluk ten minste vijf gesynchroniseerde wormen en raak voorzichtig met de voet van het handvat van de wormplectrum de levamisoldruppel aan om de wormen over te brengen. Bedek het agarosekussen voorzichtig met een dekglaasje. Controleer de locatie van de wormen, aangezien het dekglaasje de verspreiding van de wormen kan veroorzaken.

Label het microscoopglaasje met de juiste details, zoals de naam van de wormstam. Lokaliseer de wormen met behulp van een objectief met een laag vermogen op de microscoop met behulp van helderveldverlichting. Gebruik minimaal een 20x luchtobjectief of een onderdompelingsobjectief van 40x voor het duidelijk zichtbaar maken van de calciumgolf in eicellen.

Voor een optimale visualisatie van de fluorescerende reporters past u de versterkings- of belichtingstijd voor de GFP- en RFP-kanalen aan. Onderzoek elke min-één eicel in de geslachtsklierarmen van de worm om te bepalen of er een bevruchting op handen is. Na afbraak van de nucleaire envelop zal het cytoskelet van de meest proximale min-één eicel herschikken, een afgerond uiterlijk aannemen en zich scheiden van de min-twee eicel.

Wanneer de eisprong op handen is, begin dan onmiddellijk met het opnemen van de video in een breedveldomgeving. De proximale eicel wordt aangeduid met de min-één direct voor de spermatheca, waar het sperma wordt bewaard. Het meest recente embryo bevindt zich het dichtst bij de spermatheca, maar in de baarmoeder.

De calciumgolf vertoonde een bifasisch patroon, beginnend met een snelle uitbarsting gevolgd door een golf van fluorescentie die zich van het beginpunt naar de tegenoverliggende pool bewoog. Een calciumsignaal werd onmiddellijk na binnenkomst in de spermatheca waargenomen in de eerste min-één eicel, maar niet in de achterblijvende min-twee eicel. Embryo's in-utero en ex-utero vertoonden een fluorescentiesignaal in een enkele cel tijdens de embryogenese.