Structuurgeleid ontwerp en ontwikkeling van nieuwe cyclophiline A-remmers en ganoderiol-F-derivaten: een in-silico-benadering
23 juni 2026
Hier presenteren we een protocol voor het structuurgestuurde ontwerp van eiwit-ligandbindingsinteractie tussen Sanglifehrin A en Cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentieel voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. De stabiliteit van het ligand-receptorcomplex werd geëvalueerd met behulp van moleculaire dynamica-simulatie.
Dit onderzoek richt zich op het ontwerpen van nieuwe Cyclophiline A-remmers en gan-it-role antiproliferatieve middelen om de Cyclophiline DCDK-as te targeten en de proliferatie van celkanker te remmen. De belangrijkste uitdaging omvat het bereiken van optimale geometrische interactie tussen liganden en receptoren en het behouden van stabiele ligand-eiwitcomplexen onder dynamische experimentele en fysiologische omstandigheden. Om te beginnen, open je het bestand 1NMK".
Zoek het aminozuur arginine op positie nummer 55 en noteer de X-, Y- en Z-coördinaten in de AutoDock-interface. Open het menu Bestand, selecteer Moleculen lezen. Kies het bestand 1NMK" en klik op Openen.
Voeg waterstofatomen toe door Bewerken te selecteren, Waterstof te kiezen en op Toevoegen te klikken. Kies dan alleen polair en bevestig met OK. Ga daarna weer naar het menu Bewerken, kies Atomen en selecteer AD4 Atoomtype toewijzen. Kies vervolgens Charges en selecteer Kollman Charges.
Bewaar de voorbereide receptor als 1NMK. pdbqt" door Bestand te selecteren, Opslaan te kiezen, het bestandstype in te stellen en de opslaglocatie te bevestigen. Open vervolgens het menu Ligand, selecteer Invoer.
Klik op Openen, kies het PDB-bestand en klik opnieuw op Openen. Wanneer het informatievenster verschijnt, bekijk dan de liganddetails. Om de ligandwortel te detecteren, selecteer je Ligand, kies dan Torsieboom en klik op Root detecteren.
Sla de ligand op door Ligand te selecteren, Output te kiezen en op Sla als PDBQT te klikken. Bereid het receptorrooster voor door Grid te selecteren, Macromolecule te kiezen, 1NMK te selecteren en op Molecule te klikken. Bevestig de waarschuwing en sla op als 1NMK.pdbqt.
Voor het instellen van de kaarttypes selecteer je Grid, gevolgd door Set Map Types, Ligand. Kies Ligand" en selecteer tenslotte Ligand" opnieuw. Definieer vervolgens het rasterdooscentrum door Raster te selecteren, Rastervak te kiezen en op Centrum te klikken.
Selecteer vervolgens een atoom en voer de coördinaten van het rastervak in. Sla de gridparameter op als een GPF-bestand. Configureer docking door Docking te selecteren, gevolgd door Macromolecule" en stel Rigid File Name in.
Navigeer naar de vereiste map en klik op 1NMK.pdbqt. om deze te openen, selecteer Docking, kies Output, klik op Lamarckian GA en sla het dockingparameterbestand op als 1NMK.dpf. Typ in de Cygwin-terminal cd C: en druk op enter; Typ dan CD project" en druk opnieuw op enter.
Vervolgens typ je cd-moleculen" en druk je op enter. Typ dan cd 3" en druk op enter. Typ het AutoGrid"-commando om rasterkaarten te genereren en druk enter om AutoGrid uit te voeren.
Na de uitvoering typt u tail f 1NMK. glg" en druk enter om de logvoortgang te bekijken, typ het commando voor moleculaire dockingsimulatie. Om het dockinglogbestand te genereren, druk op enter om AutoDock te starten.
Typ dan tail f 1NMK. dlg" en druk enter om het dockingproces te monitoren. Nadat je alle DLG-bestanden hebt aangemaakt, ga je naar map 1 en open je het DLG-bestand in WordPad, druk op Ctrl+F.
Typ het zoekwoord in en druk drie keer op enter om bij de RMSD-tabel te komen. Kopieer de bindingsenergie en bijbehorende run-informatie voor elk molecuul uit de RMSD-tabel, verzamel de top 20 moleculen in een spreadsheet met kolommen voor serienummer, minimale bindingsenergie en voer uit. Navigeer in de Cygwin"-terminal naar de map specifieke moleculen binnen de projectmap.
Typ het commando om gedockte ligandcoördinaten uit DLG te halen en de data te trimmen. Druk nogmaals enter om het te voltooien, waarmee de aanmaak van het 1NMK-uitgevoerde PDBQT"-bestand bevestigd wordt. Controleer of het 1NMK-uitgevoerde PDB"-bestand in dezelfde map is aangemaakt.
Open vervolgens de PyMOL 2.5"-software en de AutoDock vanaf het bureaublad en open het receptorbestand om de receptorstructuur te selecteren voor visualisatie. Open het bijbehorende ligandconfiguratiebestand voor het gekozen molecuul en toon de geladen ligand in de 3D-werkruimte. Selecteer 'Alles verbergen' vanuit het menu, importeer het bestand naar Maestro om de structuur te visualiseren, en klik vervolgens op 'Ligand Interaction' om het ligandinteractiediagram te krijgen.
Open de UCSF Chimera"-software vanaf de desktop. Selecteer Bestand, gevolgd door Open. Navigeer naar drive C, project en moleculen.
Selecteer het bestand 1NMK. pdb" en klik open. Selecteer in het menu Residue en selecteer UNL Zoom om je te richten op de UNL-residuregio.
Selecteer Zone. Druk dan op OK" om te bevestigen. Selecteer vervolgens Actie.
Kies Label, selecteer daarna Residue en selecteer Naam Plus Specifier om de residuen te labelen. Open Tools, selecteer Structuuranalyse en klik vervolgens op FindHBond. In het standaard FindHBond"settings-venster, vink je de vakjes aan voor Color H-bonds That Do Not To Qualify Criteria" en vind alleen H-bonds met Selected.
Maak de zoneselectie leeg om een nieuwe survey te starten. Selecteer vervolgens de zoneparameters en zoom in op het moleculaire display, en observeer de blauwe en oranje lijnen die waterstofbruggen voorstellen. Tot slot onderzoek je de gevisualiseerde structuur en tel je het totale aantal zichtbare waterstofbruggen.
De koppelingsbevestiging van het ligand-receptorcomplex werd gevisualiseerd met PyMOL 2.5, waarbij 109 hydroxy zes hydroxyethyl gebonden waren binnen de actieve pocket van de 1NMK-receptor. De 4-hydroxymandelzuurligand vormde waterstofbruggen met de 1NMK"-receptor, met name arginine 55 op een afstand van 1,53 ångström. Tweedimensionale structurele analyse illustreerde de aminozuren waarmee de liganden via waterstofbruggen interageren.
Moleculaire dynamica-simulaties bevestigen de stabiliteit van het ligand-receptorcomplex door de analyse van de gyratiestraal van 1000 picoseconden. De RMSD-grafiek toonde een consistente stabilisatie van het complex na één nanoseconde simulatie, wat wijst op een stabiele eiwit-ligandbinding. De gemiddelde dichtheid van het systeem was ongeveer 10¹¹ kilogram per kubieke meter, wat het evenwicht onder NVT-omstandigheden bevestigt, en de druk van het systeem blijft stabiel tijdens NPT-equilibratie gedurende 100 picoseconden.
De temperatuur stabiliseerde rond de 300 kelvin tijdens de NVT-fase, wat een succesvolle thermische evenwicht bevestigde. De ligand-eiwitcomplex trajectdoos werd na de simulatie gevisualiseerd, waarbij de verdeling van watermoleculen rondom het gekoppelde complex werd getoond. Weinig studies onderzoeken gan-it-role antiproliferatief als oncogeen therapeutisch doelwit.
Dit protocol vult die kloof door inhibitoren te ontwerpen en te valideren met behulp van moleculaire docking en dynamics-analyse. Ons protocol onderzoekt meerdere computationele tools in een uniforme workflow, wat zorgt voor een uitgebreide ligand-eiwit- of receptoranalyse. Ons toekomstig onderzoek zal zich richten op het valideren van deze remmers in vitro en in vivo door de grenstoepassing van Cyclophiline A-remmers op meerdere kankerceltypen te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het ontwerp en de validatie van nieuwe Cyclophiline A-remmers die gericht zijn op de Cyclophiline D-CDK-as om de proliferatie van kankercellen te onderdrukken. Via een structuurgestuurde aanpak hebben onderzoekers 117 ligandmoleculen ontwikkeld en hun interacties met de Sanglifehrin A-enzymreceptor (1NMK) geëvalueerd middels moleculaire docking en dynamicasimulaties. De workflow integreerde meerdere computationele tools om de binding tussen ligand en receptor te optimaliseren, de stabiliteit te beoordelen en cruciale interagerende residuen te identificeren voor de potentiële ontwikkeling van antikankergeneesmiddelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Kankerfarmacologie
- Computationeel geneesmiddelontwerp
- Moleculaire docking en simulatie
Achtergrond
- Cyclophiline A (Cyp A) is betrokken bij de progressie van kanker via de regulatie van proliferatie en celoverleving.
- De Cyclophiline D-CDK-as vormt een veelbelovend therapeutisch doelwit in de oncologie.
- Ganoderiol F-derivaten hebben potentieel getoond als oncogene doelwitten bij meerdere kankertypen.
- Nauwkeurige voorspelling van ligand-receptorinteracties vereist robuuste computationele modellering.
Doel van de studie
- Het ontwerpen van nieuwe Cyclophilin A-remmers met behulp van structuurgeleide methoden.
- Het evalueren van de bindingsaffiniteit tussen ligand en receptor en de geometrische compatibiliteit via docking.
- Het bevestigen van de stabiliteit van het complex door middel van moleculair dynamische simulaties.
- Het identificeren van sleutelaminozuurresiduen die betrokken zijn bij waterstofbrugvorming met lead-liganden.
Gebruikte methoden
- Chemsketch voor het construeren van 117 nieuwe cyclofiline-remmende ligandmoleculen.
- AutoDock 4.2.6 voor ligand-eiwit-docking om optimale bindingsgeometrieën te bepalen.
- PyMOL 2.5 voor het visualiseren van docking-poses en ligand-receptor-interacties.
- Chimera en Maestro voor het detecteren en analyseren van waterstofbruggen.
- Gromacs met CHARMM 36 force field voor moleculaire dynamicasimulatie van het ligand-receptorcomplex.
Belangrijkste resultaten
- Arginine 55 in de 1NMK-receptor vormde een waterstofbrug met het ligand op een afstand van 1,53 Å.
- Belangrijke interagerende residuen waren Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe en Cys.
- Het ligand vormde 45 waterstofbruggen met de receptor, wat wijst op een sterk bindingspotentieel.
- De docking-box was gecentreerd op X=38,86, Y=10,987, Z=40,734 in de 1NMK-receptor.
- MD-simulatie in Gromacs toonde stabilisatie van het complex na 1 ns, met een consistente RMSD en gyratie-straal.
- Het systeem behield het evenwicht onder NVT/NPT-condities, met een gemiddelde dichtheid van ~1019 kg/m³ en een stabiele druk en temperatuur (~300 K).
Conclusies
- Het ontworpen ligand-receptorcomplex vertoont voldoende stabiliteit voor verdere ontwikkeling als kankertherapie.
- Arginine 55 speelt een cruciale rol bij de ligandbinding binnen de actieve site van Cyclophiline A.
- De geïntegreerde computationele workflow identificeert met succes veelbelovende Cyp A-remmers.
- Toekomstig werk zal zich richten op in vitro- en in vivo-validatie in meerdere kankerceltypen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executives
Structuurgeleid computationeel ontwerp maakt een snelle identificatie mogelijk van Cyclophiline A-remmers met een geoptimaliseerde binding aan de Cyclophiline D-CDK-as, een gevalideerd oncologisch doelwit. Deze aanpak vermindert het uitvalpercentage in de vroege fase door prioriteit te geven aan liganden met een sterke voorspelde doelwitinteractie en complexstabiliteit. De workflow ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen door docking, interactieanalyse en moleculaire dynamica te integreren om mechanistische hypothesen te stroomlijnen voordat synthese plaatsvindt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door ligandinteracties met Cyclophiline A op atomaire resolutie te modelleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door voorspelling van de bindingsaffiniteit en betrokkenheid van cruciale residuen, zoals Arginine 55.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetmodulatie door het identificeren van liganden die meerdere waterstofbruggen vormen, waaronder de 45 die waargenomen zijn in het leidende complex.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gevalideerde ligand-receptorcomplexen die geschikt zijn voor de ontwikkeling van biochemische of biofysische assays.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert docking-parameters (gridcentrum op X=38.86, Y=10.987, Z=40.734) en scoring voor consistente virtuele screening.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de evaluatie van grote ligandbibliotheken (117 geconstrueerde moleculen) middels geautomatiseerde docking-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Richt zich op Cyclophilin A, betrokken bij de proliferatie en overleving van kanker in meerdere tumortypes.
- Translationele continuïteit: Biedt een mechanistische brug van in-silico ontwerp naar toekomstige in vitro en in vivo validatie.
- Risicoreductie: Evalueert complexe stabiliteit via RMSD en de gyratie-straal, ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen voorafgaand aan de synthese van verbindingen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor computationele triage mogelijk is voorafgaand aan wet-labtesten.
- Discovery Biology: Test therapeutische hypothesen door te modelleren hoe liganden de functie van Cyclophilin A in de D-CDK-as remmen.
- Screening: Levert assay-klare outputs via gestandaardiseerde docking-poses en ranglijsten van bindingsenergie voor de prioritering van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metrieken (bindingsenergie, aantal waterstofbruggen, RMSD) om de prestaties van liganden te vergelijken en optimalisatie te sturen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt computationele hits met preklinische voortgang door de stabiliteit van complexen te valideren over een simulatie van 1000 ps.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbare pipeline voor het targeten van andere eiwit-eiwitinteracties met behulp van dezelfde tool-integratie (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie door voorspelling van ligand-receptorinteracties en identificatie van kritieke bindingsresiduen.
- Operationele waarde: Standaardisatie van de workflow over verschillende tools vermindert variabiliteit en maakt samenwerking tussen teams mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door verbindingen te filteren op basis van voorspelde stabiliteit en target-engagement.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van chemotypes met sterke docking-scores en MD-bevestigde stabiliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in moleculaire modellering, docking-software (AutoDock) en simulatieplatforms (Gromacs).
- Toegang tot computationele infrastructuur voor gridgeneratie, docking en MD-simulatie van eiwit-ligandsystemen.
- Standaardisatie van protocollen voor ligandvoorbereiding, ladingstoewijzing (Kollman) en het opslaan van gridparameters.
- Overwegingen voor aanpassing aan verschillende receptorsystemen buiten 1NMK, inclusief het opnieuw centreren van de gridbox en residuspecifieke analyse.
- Beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de nauwkeurigheid van het krachtveld (CHARMM 36) en simulatietijdschalen voor het vastleggen van zeldzame bindingsgebeurtenissen.
