Isolatie van chondrocyten en chondroprogenitoren met behulp van fibronectine-adhesie en migratoire assay

Op het gebied van kraakbeenweefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde is er nog steeds behoefte aan het verbeteren van biologische en functionele resultaten in termen van het verbeteren van lopende behandelingen en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën. Huidig preklinisch onderzoek wijst op het mogelijke gebruik van van kraakbeen afgeleide chondroprogenitors als een haalbare optie voor kraakbeengenezing. Huidig onderzoek omvat strategieën om het chondrogene potentieel verder te verbeteren met behoud van een lagere hypertrofische potentie door het gebruik van aanvullende groeifactoren en genrecombinante technieken.

Chondroprogenitors worden geconfronteerd met experimentele uitdagingen, waaronder een gebrek aan consensus over nomenclatuur, diverse isolatietechnieken, karakteriseringsproblemen, variabiliteit in cultuuromstandigheden en beperkt begrip van onderliggende mechanismen. Klinisch aantonen dat chondroprogenitors positieve resultaten opleveren in vergelijking met veelgebruikte cellen, zou de globale belasting die gepaard gaat met kraakbeengerelateerde pathologieën aanzienlijk kunnen verminderen. Evolutie van verbeterde therapieën met behulp van celvrije alternatieven, zoals extracellulaire blaasjes afgeleid van voorlopers, en met behulp van recombinante strategieën voor de regeneratie van echt hyalienachtig kraakbeen.

Verkrijg om te beginnen tibiofemorale of kniegewrichten van menselijke donoren in 1X PBS onder steriele omstandigheden en breng vervolgens de geoogste gewrichten over op het steriele onderkussen in de kap. Om de gewrichten te stabiliseren, houdt u het subchondrale bot vast met het kraakbeen naar boven gericht. Oogst met behulp van een scalpelmes nummer 22 rechthoekige kraakbeenkrullen van de niet-dragende gebieden.

Snijd het kraakbeen in secties van acht millimeter bij 10 millimeter van de oppervlakkige laag naar de diepere laag. Nadat je de plakjes met PBS hebt gewassen, doe je ze in een petrischaal met een tot twee milliliter gewone Dulbecco gemodificeerde Eagle's medium, of DMEM. Hak vervolgens met een scalpelmes nummer 22 de plakjes kraakbeen fijn tot een grootte kleiner dan een kubieke millimeter.

Verkrijg om te beginnen gehakt kraakbeen van geëxtraheerde menselijke kniegewrichten. Plaats het gehakte kraakbeen in een rechtopstaande T25-kolf met 10 milliliter serumvrije DMEM/F-12 met 0,15% collagenase type II voor enzymatische spijsvertering. Laat de kolf 12 tot 14 uur ongestoord in een kooldioxide-incubator staan.

Breng na een nachtelijke spijsvertering het medium met de vrijgekomen chondrocyten over in een verse steriele centrifugebuis. Gebruik een celzeef om de cellen van het puin te scheiden. Voeg een gelijk volume DMEM/F-12 toe met 10% foetaal runderserum of FBS.

Centrifugeer de gefilterde cellen gedurende vijf minuten bij 1.200 G bij 37 graden Celsius. Nadat u het bovenstaande hebt weggegooid, reconstitueert u de pellet in een milliliter medium. Tel de levensvatbare cellen met behulp van een trypanblauwe uitsluitingstest.

Laad vervolgens de chondrocyten in een T25-kolf met een concentratie van 10.000 cellen per vierkante centimeter. Breid de cellen uit tot het gewenste doorgangsnummer met behulp van DMEM/F-12 met 10%FBS. Ververs het medium om de drie dagen voordat u de cellen bij subconfluence oogst met 0,125% trypsine die EDTA bevat.

Chondrocyten hechtten zich onmiddellijk na het laden en gingen over van een afgeronde geplaveide vorm naar een fibroblastisch uiterlijk naarmate ze uitzetten. Verkrijg om te beginnen kraakbeenkrullen van geëxtraheerde menselijke tibiofemorale of kniegewrichten. Onderwerp de kraakbeenkrullen 's nachts aan een sequentiële enzymatische vertering, eerst met 0,2% pronase gedurende drie uur, gevolgd door 0,04% collagenase type II gedurende 12 uur in een schudwaterbad dat op 37 graden Celsius wordt gehouden.

Smeer vervolgens het vereiste aantal putjes van een plaat met zes putjes in met 1,5 milliliter PBS-fibronectineoplossing. Sluit de plaat goed af en zet een nacht in de koelkast bij vier graden Celsius. Haal de volgende dag de met fibronectine beklede plaat met zes putjes uit de koelkast.

Voeg na het verwijderen van overtollig fibronectine twee tot drie milliliter gewoon DMEM/F-12-medium toe aan de gecoate putjes. Zaai de vrijgekomen chondrocyten op de gecoate putjes met een dichtheid van 4.000 cellen per putje en laat de plaat 20 minuten ongestoord. Zuig na incubatie de overtollige media en niet-aanhangende cellen op.

Voeg twee tot drie milliliter DMEM/F-12 met 10% foetaal runderserum toe aan de putjes. Houd de aanhangende cellen gedurende 10 tot 12 dagen onder standaard kweekomstandigheden om chondrogene voorlopercellen of CPC-klonen te verkrijgen, isoleer vervolgens de CPC-klonen met behulp van 0,125% trypsine EDTA gedurende 180 seconden en speel vervolgens opnieuw af in een verhouding van één kloon per vijf vierkante centimeter. Breid de verrijkte polyklonale CPC's uit tot de vereiste samenvloeiing.

Chondrocyten die zijn onderworpen aan een fibronectine-adhesietest vertonen klonale groei en bereiken een verdubbeling van de populatie van vijf op dag 10. Verkrijg om te beginnen de geschoren kraakbeenexplantaten van het geoogste gewrichtsgewricht in aangevuld DMEM/F-12-medium. Plaats de plaat met explantaten gedurende 48 uur in een kooldioxide-incubator die is ingesteld op 37 graden Celsius.

Breng de explantaten na twee dagen over naar een centrifugebuis met 10 milliliter 0,1% collagenaseoplossing voor enzymatische vertering. Incubeer de buis twee uur lang bij 37 graden Celsius. Spoel de explantaten na de spijsvertering af met 1X PBS en doe ze terug in dezelfde putjes in de plaat met vers aangevuld DMEM/F-12-medium.

Onderhoud de plaat in de broedmachine onder de standaard kweekomstandigheden en controleer de migratie van chondroprogenitors gedurende de daaropvolgende dagen. Zodra de explantaten de subconfluentie bereiken, oogst u de mesenchymale chondroprogenitorscellen of MCP's met behulp van 0,125% trypsine EDTA-oplossing. Breid de MCP's uit met het aangevulde DMEM/F-12 medium.

Chondroprogenitors beginnen op dag 10 van de teelt te migreren vanaf de rand van de explantatie en vertonen een spoelvormig groeipatroon met verdere uitbreiding.