Screening van covalente fragmenten met behulp van de kwantitatieve onomkeerbare tethering-assay
February 28th, 2025
De kwantitatieve irreversibele tethering (qIT)-test is een op fluorescentie gebaseerde methode voor het identificeren van covalente fragmenten die selectief een doeleiwit aangaan. Hier wordt een gedetailleerd protocol geschetst om de qIT-test te beschrijven, inclusief voorbeeldresultaten.
We werken samen tussen de departementen chemie en biowetenschappen en ontwikkelen nieuwe assisterende reactieve covalente liganden voor een reeks doelwitten tegen kanker. Het is te hopen dat deze moleculen in de toekomst zullen worden gebruikt, hetzij als therapieën, hetzij mogelijk als chemische sondes. Er bestaan dus verschillende technologieën voor het screenen van covalente liganden.
Deze kunnen grofweg worden opgesplitst in proteomische technieken waarbij verbindingen worden geïncubeerd met gekweekte cellen en massaspectrometrie die wordt gebruikt om te bepalen welke eiwitten de moleculen labelen en op doelen gebaseerde methoden waarbij bibliotheken van elektrofielen worden geïncubeerd met individuele eiwitten. Een belangrijke experimentele uitdaging heeft betrekking op de reactiviteit van covalente liganden. Overdreven reactieve moleculen verschijnen vaak als treffers tijdens screeningstests, maar zijn ongeschikt omdat ze niet-selectief veel verschillende eiwitten in de cel labelen.
De samenstelling van de activiteit is daarom van cruciaal belang om in overweging te nemen bij elke stap van de ontdekking van covalente geneesmiddelen. Dus hebben de Mann- en Armstrong-groepen bij Imperial een nieuwe methode ontwikkeld om elektrofielen te screenen tegen een eiwitdoelwit, de kwantitatieve onomkeerbare tethering of de qIT-assay. Ons protocol biedt een broodnodige, nieuwe methode om elektrofielen te screenen op een eiwitdoelwit, die schaalbaar is, geen massaspectrometrie vereist en controles op intrinsieke reactiviteit van de verbinding.
Bereid om te beginnen alle benodigde voorraadoplossingen voor en laat ze twee uur voor het experiment op kamertemperatuur staan. Ontgas kwantitatieve, onomkeerbare tethering of qIT-assaybuffer met argongas gedurende ongeveer 30 minuten. Voor een uitvoerende bufferuitwisseling verdunt u de eiwitoplossing boven de ontgaste qIT-assaybuffer in een spinfiltereenheid en draait u gedurende 15 minuten bij 4.000 G bij vier graden Celsius om het eiwit te concentreren.
Verdun vervolgens de doeleiwitoplossing tot een concentratie van 15 microkiezen in ontgaste qIT-assaybuffer om negen milliliter van de oplossing te bereiden. Doseer TCEP-agrase-oplossing, qIT-buffer en glutathionvoorraad in de daarvoor bestemde putjes van de platen met 384 putjes. Breng 1,8 microliter over uit elk corresponderend putje van de fragmentbibliotheekplaat om een samengestelde verdunningsplaat te maken die elke verbinding verdunt tot 1,5 millimolair in qIT-assaybuffer, plus 3% DMSO.
Gebruik een 384-pipetteerstation om 20 microliter samengestelde oplossing uit elk putje van de verdunningsplaat van de verbinding over te brengen naar beide reactieplaten. Zet om te beginnen de kwantitatieve onomkeerbare tethering of qIT-assay op met het gewenste eiwit en glutathion. Doseer 500 micromolaire CPM-voorraad in aliquots van 111,2 microliter in microcentrifugebuisjes en bewaar ze bij 20 graden Celsius.
Voeg na het ontdooien van de CPM-voorraad deze toe aan 40 milliliter qIT-testblusbuffer om een oplossing van 1.4 micromolair te bereiden Doseer 27 microliter CPM-blusoplossing in elk putje van twee, verse platen met 384 putjes. Centrifugeer de eiwitreactieplaat gedurende drie minuten bij 200 G om TCEP-agarose te pelleteren. Gebruik op vooraf bepaalde tijdstippen een 384-pipetteerstation om drie microliter monster uit elk putje van de eiwitreactieplaat over te brengen naar de CPM-quenchplaat.
Verwijder het monster van de bovenkant van het putje en vermijd het opzuigen van TCEP-agarose op de bodem. Incubeer de CPM-quenchplaten gedurende één uur bij kamertemperatuur en meet de fluorescentie-intensiteit met een excitatie op 384 nanometer en emissie op 470 nanometer. Voer om te beginnen kwantitatief-onomkeerbare tethering of de qIT-test uit met het gewenste eiwit en blus de monsters in de CPM-plaat.
Bereken voor elke quench Z-priemgetal als maat voor de testkwaliteit. Bereken vervolgens de gemiddelde fluorescentiewaarden voor de negatieve controleputjes in de kolommen één en twee en de positieve controleputjes in de kolommen 23 en 24. Normaliseer elke reactie goed naar de gemiddelde fluorescentiewaarden van de positieve en negatieve controles, en zet het gewijzigde percentage afzonderlijk uit tegen de tijd voor elke verbinding die reageert met glutathion en met het doeleiwit.
Gebruik GraphPad om genormaliseerde percentage gemodificeerde versus tijdgegevens aan te passen aan een eenfasig exponentieel vervalmodel voor zowel de reacties met behulp van de vergelijking, AE als de macht van KT C. Gebruik de snelheid waarmee fragmenten reageren met eiwit en glutathion om de snelheidsverbeteringsfactor of REF-waarde voor elk fragment te berekenen. Als u ten slotte Hit-fragmenten wilt selecteren, stelt u een REF-drempel in, een willekeurige Hit Rate, of selecteert u fragmenten met REF drie standaarddeviaties groter dan het geometrische gemiddelde. Verbinding één reageerde met het cysteïneresidu op het doeleiwit met een zesvoudige hogere snelheid dan met glutathion, en voldeed aan het Hit-criterium van REF groter dan drie.
Verbinding twee vertoonde geen versnelde reactiesnelheid met het doelcysteïneresidu in vergelijking met glutathion, wat wijst op een gebrek aan productieve niet-covalente interacties en werd daarom niet geselecteerd als een treffer.
Overzicht
De kwantitatieve irreversibele tethering (qIT) test is een op fluorescentie gebaseerde methode ontworpen om covalente fragmenten te identificeren die selectief interageren met doelwitten. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de qIT test, inclusief voorbeeldresultaten om de toepassing te illustreren.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Covalente geneesmiddelontdekking
- Op fluorescentie gebaseerde tests
- Interacties tussen eiwitten en liganden
Achtergrond
- Ontwikkeling van reactieve covalente liganden voor anti-kanker doelwitten.
- Uitdagingen bij het screenen van covalente liganden vanwege hun reactiviteit.
- Bestaande methoden omvatten proteomische technieken en doelwit-gebaseerde methoden.
- De behoefte aan een schaalbare methode die de reactiviteit van verbindingen controleert.
Doel van het Onderzoek
- Om de qIT test te introduceren als een nieuwe methode voor het screenen van elektrofielen tegen eiwitdoelwitten.
- Om een protocol te bieden dat geen massaspectrometrie vereist.
- Om de selectiviteit van covalente liganden in de geneesmiddelontdekking te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van voorraadoplossingen en degassering van qIT testbuffer.
- Eiwitconcentratie en verdunning in qIT testbuffer.
- Gebruik van 384-well platen voor het verdunnen van verbindingen en het opzetten van reacties.
- Meting van fluorescentie-intensiteit om de reactiviteit van verbindingen te beoordelen.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van hit fragmenten op basis van hun reactiesnelheid met doelwitten.
- Berekening van rate enhancement factors (REF) om de selectiviteit te bepalen.
- Voorbeeldresultaten die de effectiviteit van de qIT test demonstreren.
- Vergelijking van de reactiviteit van verbindingen met glutathion en doelwitten.
Conclusies
- De qIT test biedt een robuuste methode voor het screenen van elektrofielen.
- Het maakt de identificatie van selectieve covalente liganden mogelijk.
- Deze methode kan het veld van covalente geneesmiddelontdekking bevorderen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Covalent fragment screening using the quantitative irreversible tethering (qIT) assay addresses a critical challenge in early drug discovery: distinguishing selective covalent binders from broadly reactive compounds. By normalizing for intrinsic compound reactivity and providing quantitative selectivity metrics, qIT enhances predictive confidence at the hit identification and triage stage. This capability supports risk-adjusted portfolio advancement and reduces downstream attrition due to non-selective reactivity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of covalent ligand selectivity for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying target-specific reactivity versus off-target background.
- Facilitates prioritization of fragments with favorable selectivity profiles for further development.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, fluorescence-based assay platform for high-throughput screening of electrophilic libraries.
- Standardizes quantitative measurement of reaction rates with both target proteins and glutathione controls.
- Enables reproducible identification of selective hits based on rate enhancement factor (REF) thresholds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early hit selection with translational requirements by excluding broadly reactive or promiscuous compounds.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by generating robust, quantitative selectivity data.
- Reduces risk of late-stage failure due to non-specific covalent modification in complex biological systems.
Pipeline & Workflow Integration
The qIT assay integrates at the hit identification and validation stage, bridging early discovery and lead optimization for covalent ligand programs.
- Discovery Biology: Quantifies selective covalent engagement, supporting hypothesis-driven target validation.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible, and quantitative outputs for compound triage.
- Analytics: Generates REF values and normalized kinetic data to compare compound selectivity.
- Translational Research: Informs preclinical candidate selection by excluding non-selective electrophiles.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein targets and electrophilic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hit selectivity and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes and scales covalent screening workflows without mass spectrometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by prioritizing selective hits.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage attrition from non-selective reactivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence-based assay setup and kinetic data analysis.
- Needs access to 384-well plate handling and compatible fluorescence plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and normalization procedures.
- Adaptable to various protein targets and electrophilic fragment libraries.
- Dependent on robust statistical analysis for hit threshold determination and data quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:16
Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
2:48
CPM-Quenching to Quantify the Amount of Unreacted Thiol Remaining in the Protein and Glutathione Reaction Plates of Quantitative-Irreversible Tethering Assay
4:18
Data Analysis and Hit Selection After the Quantitative-Irreversible Tethering Assay for Electrophilic Ligand Screening
