Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken

Het belangrijkste doel van deze procedure is het implementeren van een uitgebreid protocol voor de kweek en karakterisering van microfagen op verschillende implantaatoppervlakken en karakterisering van de subtypes van de microfagen. Als onderdeel van deze karakterisering worden verschillende methoden gebruikt, waaronder qRT-PCR, EISA en CLSM, om de genexpressieprofielen, secretoire eiwitten en celoppervlaktemarkers te bepalen. De resultaten tonen het nut en de effectiviteit van het geïmplementeerde protocol aan bij het polariseren van microfagen en implantaatoppervlakken, en het nauwkeurig identificeren ervan op basis van genexpressie, uitgescheiden eiwitten en markers op het celoppervlak.

Bovendien beschrijven de markers revolt-consistente en specifieke expressiepatronen die kunnen worden gebruikt om verschillende subtypes van MDM's te onderscheiden. Over het algemeen zal de studie bijdragen aan de ontwikkeling en het ontwerp van immunomodulerende materialen om succesvolle weefselregeneratieprocessen te verbeteren en te bevorderen, implantaat-geassocieerde chronische ontsteking te voorkomen en de succesvolle implantaatintegratie te verbeteren. Om te beginnen, suspendeer de geïsoleerde menselijke perifere bloedmononucleaire cellen in 15 milliliter voorverwarmd monocytbevestigingsmedium en breng ze over naar een T-75-celkweekkolf.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 90 minuten voor hechting. Gooi na de incubatie het supernatant weg en was de cellen eenmaal met een voorverwarmd RPMI 1640 Medium, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline en streptomycine door de kolf voorzichtig te kantelen om niet-aanhangende of losjes aanhangende cellen te verwijderen. Voeg 15 milliliter compleet medium met 10 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor toe aan de aanhangende cellen.

En broed zes dagen om differentiatie te bevorderen. Verwijder na differentiatie het kweekmedium uit de kolf en was de cellen gedurende vijf minuten met 10 milliliter PBS. Om de adherencecellen los te maken, voegt u 10 milliliter voorverwarmde celloslatingsoplossing toe en incubeert u gedurende 30 minuten.

Tik vervolgens voorzichtig op de kolf om de cellen vrij te geven en breng ze over in een buis van 50 milliliter. Om de resterende cellen los te maken, voegt u 10 milliliter PBS toe aan de kolf en schroot u de cellen. Breng de losgemaakte cellen over in de buis van 50 milliliter.

Centrifugeer de losgemaakte celsuspensie gedurende 10 minuten bij 300 g en gooi het bovenstaande weg voordat u de cellen opnieuw suspendeert in vijf milliliter voorverwarmd volledig medium. Tel met behulp van trypanblauwe kleuring de cellen op een hemocytometer om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te bepalen. Bereid de celsuspensie voor door het celnummer aan te passen aan 160.000 cellen per milliliter compleet medium.

Reinig vervolgens de biomateriaalschijven ultrasoon in 70% ethanol gedurende vijf minuten, gevolgd door sterilisatie in 70% ethanol gedurende 30 minuten. Na het drogen van de titanium schijven, plaatst u ze in een niet-behandelde plaat met 24 putjes en voegt u een milliliter voorbereide celsuspensie toe aan elk putje. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om M0-macrofagen te verkrijgen.

Om M1-gepolariseerde macrofagen te verkrijgen, voegt u interferon-gamma en lipopolysaccharide toe aan de putjes van een plaat met 24 putjes. Voeg voor M2-polarisatie interleukine-4 en interleukine-13 toe. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om polarisatie te induceren.

Na het verkrijgen van gepolariseerde, van monocyten afgeleide macrofagen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen, verzamelt u het celsupernatans in een buis van 1,5 milliliter. Breng de titanium schijf over op een nieuwe plaat met 24 putjes. Centrifugeer het celsupernatans bij 300 g gedurende vijf minuten en breng het supernatans over in een nieuw buisje.

Meet de cytokines en chemokines op 450 nanometer volgens de specifieke instructies van de fabrikant. Bereken de concentratie van uitgescheiden cytokines of chemokinen met behulp van de standaardcurve. Meet de totale hoeveelheid eiwit met behulp van de bicinchoninezuur-eiwittestkit.

Normaliseer de concentratie van uitgescheiden eiwitten tot milligram totaal eiwit. Was de gepolariseerde macrofagen twee keer in 800 microliter PBS. Incubeer de schijven in 400 microliter fixatiebuffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Was de schijven na het verwijderen van de fixatiebuffer drie keer in 400 microliter PBS. Incubeer nu de schijven met 400 microliter blokkeerbuffer gedurende 30 minuten om de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Gooi de blokkeerbuffer weg en incubeer de schijven gedurende een uur met primaire antilichamen verdund in 400 microliter kleuringsbuffer.

Verwijder na een uur de primaire antilichamen en was de schijven drie keer met 400 microliter wasbuffer. Voeg fluor toe voor geëtiketteerde secundaire antilichamen verdund in kleuringsbuffer en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de monsters na de incubatie driemaal gedurende drie minuten in de wasbuffer.

Voeg 10 millimolaire DRAQ5 toe in PBS en incubeer gedurende 15 minuten in het donker. Verwijder vervolgens het bovenstaande en was de schijven eenmaal met PBS. Voeg een druppel montagemateriaal toe, breng na vijf minuten de dekglaasjes aan en laat de monsters een uur drogen.

Sluit na het drogen de randen af met doorzichtige nagellak. Om een overzicht van cellen te krijgen, maakt u de monsters fotoal op een confocale laserscanmicroscoop onder een vergroting van 25x. Verander de vergroting in 63X om de structuur en lokalisatie van oppervlaktemarkeringen te bepalen.

Primaire van monocyten afgeleide macrofagen werden met succes gepolariseerd in M1- en M2-macrofagen op titaniumoppervlakken, waarbij CCR7 sterker tot expressie kwam in M1-macrofagen en CD209 in M2-macrofagen. qRT-PCR-analyse toonde succesvolle polarisatie van primaire monocyt-afgeleide macrofagen op zowel titanium als dekslipoppervlakken met hoge expressie van CCR7 en TNF-alfa voor M1 en CD209 en CCL13 voor M2. Hoge niveaus van inflammatoir TNF-alfa-cytokine en CCL13-chemokine bevestigden M1- en M2-polarisatie op eiwitniveau.