Kwantificering van mitochondriale ademhaling in hele gistcellen

Mitochondriale ademhaling is onder de meeste omstandigheden een belangrijke generator van cellulaire energie en een belangrijke indicator van cellulair metabolisme en fitheid. Mitochondriale functies bakenen dus de bio-energetische cellulaire toestand af. Dit protocol beschrijft een techniek voor het kwantificeren van mitochondriale ademhaling in levende G-cellen als een bio-energetische parameter.

De techniek die in dit protocol wordt beschreven, helpt ons bij het definiëren van het bio-energetische mechanisme van sommige polyfenolen, zoals resveratrol en coirciteen. Het dient ook als een hulpmiddel om het pentosemetabolisme te meten, ook van PTSPT's en verklaarde bio-energetische veranderingen achter de cabineboom en grondwerkeffecten. We zijn geïnteresseerd in het ontcijferen van hoe cellen sommige fenotypes verkrijgen, zoals cab tree- en grondwerkeffecten, met significante veranderingen in cellulaire bio-energetica.

Mitochondriale ademhaling is een essentieel hulpmiddel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen achter dit metabolische fenomeen. Inoculeer om te beginnen een glazen reageerbuis van 10 milliliter met drie milliliter YPD-medium met 250 microliter glycerol geconserveerde gistcellen. Incubeer de reageerbuis een nacht bij 30 graden Celsius met constant roeren met 200 omwentelingen per minuut.

Streep vervolgens met behulp van een steriele lus een YPD-vijzelplaat met de gistcellen die in de glazen reageerbuis van 10 milliliter zijn gegroeid. Incubeer de petrischaal bij 30 graden Celsius totdat er geïsoleerde kolonies verschijnen. Om een pre-inoculum voor te bereiden, inoculeert u drie milliliter YPD-medium bij 2% glucose met twee of drie geïsoleerde gistkolonies en incubeert.

Verkrijg vervolgens 100 milliliter steriel synthetisch compleet medium in een erlenmeyer van 500 milliliter. Inoculeer de media met de nachtelijke pre-inoculum gistcultuur bij een initiële optische dichtheid van 0,1 bij 600 nanometer. Voeg de chemische uitdaging toe, zoals 100 micromolaire resveratrol om de mitochondriale ademhaling te testen.

Giet vervolgens de cellen in de mid-logfase in een lege, vooraf gewogen conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 4.000 G. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, wast u de pellet drie keer met 25 milliliter gedeïoniseerd water. Weeg de conische buis met de gewassen pellet om het natte gewicht te verkrijgen door het gewicht van de lege buis af te trekken.

Resuspendeer vervolgens de gewassen pellet opnieuw in twee milliliter gedeïoniseerd water. Verkrijg om te beginnen de gistcellen die zijn behandeld met de juiste medicijnen, zoals resveratrol. Plaats vijf milliliter 10 millimolaire MES-TEA-buffer en 50 milligram natte cellen in de polaire transplantaatkamer.

Plaats de zuurstofelektrode van het Clark-type voorzichtig en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd. Schakel de YSI 5300A-monitor en de gegevensverzamelingscomputer in. Selecteer de instelknop voor kanaal één op lucht en stel kanaal één in op 100% met de kalibratieknop voor kanaal één.

Begin met het registreren van de gegevens en begin met het meten van de tijd met behulp van een chronometer. Voeg met behulp van een chromatografiespuit het oxideerbare substraat toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolair en houd de kamer gesloten onder constant roeren. Voeg vervolgens met behulp van een chromatografiespuit oligomycine toe om een uiteindelijke concentratie van 0,01 millimolair in de oximeterkamer te verkrijgen en noteer het luchtpercentageverbruik.

Voeg op dezelfde manier CCCP toe aan een uiteindelijke concentratie van 0.015 millimolair in de oximeterkamer om de maximale ademhalingscapaciteit te bepalen. Voeg vervolgens remmers van de elektronentransportketen, tand- en olietriflurositon, of TTFA, toe aan één millimolair, gevolgd door antimycine A aan één milligram per milliliter. Was de kamer drie keer met 70% ethanol, gevolgd door gedeïoniseerd water, voordat u doorgaat naar de volgende koolstofbron.

Voer om te beginnen een zuurstofverbruikstest uit met gistcellen, met behulp van verschillende koolstofbronnen en controles. Maak een nieuw projectbestand aan in de statistische software en kies XY in de sectie maken. Selecteer vervolgens enter of importeer gegevens in een nieuwe tabel in de sectie Gegevenstabel.

Selecteer in de sectie opties nummers in de subsectie X en in de subsectie Y. Klik op voer drie gerepliceerde waarden in subkolommen naast elkaar in. Voer tijdgegevens in de X-kolommen in en voer de luchtpercentagegegevens in de Y-kolommen in.

Als u een lineaire regressieanalyse wilt uitvoeren, klikt u op analyseren in de menubalk en selecteert u onder analyse eenvoudige lineaire regressie op XY-analyse en klikt u vervolgens op OK. Haal de hellingswaarde op uit de sectie resultaten in gegevenstabellen. Kopieer de berekende hellingswaarden naar een gegevensblad.

Trek de hellingswaarde verkregen uit het mengsel van respiratoire remmers af van die van het oxideerbare substraat, oligomycine en CCCP om andere bronnen van zuurstofverbruik weg te gooien. Vermenigvuldig nu de hellingswaarden met 237 micromolair zuurstof, wat de oplosbaarheid van zuurstof in die toestand vertegenwoordigt, en buffer. Zet de waarden om in micromolaar zuurstof per minuut en pas deze aan op basis van de geplotte tijd.

Deel de resultaten door 50, wat staat voor de milligram cellen die in het experiment zijn gebruikt. Ten slotte wordt het zuurstofverbruik uitgedrukt als micromolaar zuurstof per milligram cellen per minuut. Cellen gekweekt in 0,5% glucose vertoonden een significant hoger zuurstofverbruik bij basale ademhaling, ATP-gekoppelde ademhaling en maximale ademhalingscapaciteit, vergeleken met cellen gekweekt in 5% glucose.

Quercetine verminderde de mitochondriale ademhaling aanzienlijk in cellen gekweekt met 0,5% glucose, wat de basale, ATP-gekoppelde en maximale ademhaling beïnvloedde. Aan de andere kant had quercetine geen significante invloed op de mitochondriale ademhaling in cellen, gekweekt in 5% glucose.