Geoptimaliseerde en vereenvoudigde techniek voor de productie en kweek van nauwkeurig gesneden leverschijfjes

Protocollen voor het produceren en kweken van nauwkeurig gesneden leverschijfjes, of PCLS, kunnen drastisch variëren. Het grootste nadeel van PCLS is hun korte halfwaardetijd, maar hier tonen we aan dat het produceren en kweken van PCLS kan worden bereikt in standaard laboratoriumomstandigheden met toegang tot Vibratome, terwijl een halfwaardetijd van ten minste vier dagen wordt gegarandeerd. PCLS, een aantrekkelijk model dat de gaten opvult tussen in vitro en in vivo modellen, maar ze worden vaak verwaarloosd vanwege hun relatief korte halfwaardetijd. Ze bevatten echter alle celtypen en een geconserveerde architectuur, essentieel voor metabole sommatie, en lijken daarom op een minimodel van het hele orgaan, waardoor levende weefsels kunnen worden bestudeerd en behandeld terwijl hun complexe fenotypes worden gerepliceerd. Continu plakken is een heel eenvoudig proces, maar technisch uitdagend. Om dit mogelijk te maken, richt ons protocol zich op belangrijke stappen, zoals de oriëntatie van het snijden en de inbedding van het weefsel, maar ook op de relevantie van een minimodelvolume voor kweek en een dynamisch systeem om hun halfwaardetijd te verlengen.

[Verteller] Bereid voor de oogst een liter Krebs-Henseleit-buffer, een gedesinfecteerde en gekoelde Vibratome-tray, geautoclaveerde Vibratome-messen en 4% laagsmeltende agarose voor. Bewaar de gesmolten agarose op de dag van de oogst tot gebruik in een waterbad op 37 graden Celsius. Bereid vervolgens de kweekplaten voor door 2,6, 1,5 en 0,7 milliliter complete media per putje toe te voegen aan respectievelijk platen met zes, 12 en 24 putjes. Steek poreuze inzetstukken van acht micrometer in elk putje. Plaats de platen in een bevochtigde broedmachine die is ingesteld op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 21% zuurstof. Steriliseer alle instrumenten die nodig zijn voor de oogst met behulp van geschikte sterilisatiemethoden. Spuit de buik van de geëuthanaseerde muis in met 70% ethanol om het gebied te desinfecteren. Snijd met een steriele tang en schaar de huid en het buikvlies vanaf het midden van de buik om de buikholte te openen. Ontleed de lever voorzichtig van de omliggende organen of bloedvaten en vermijd schade aan de lobben. Bewaar vervolgens de hele lever direct in de ijskoude Krebs-buffer. Gebruik een stompe tang en een scherp, steriel mes of schaar om elke lob afzonderlijk te scheiden om beschadiging van de lobben tijdens het scheiden te voorkomen. Snijd met een scherp, steriel mes alle randen van de gekozen lob bij om rechte, hanteerbare randen te creëren om in te bedden. Giet vervolgens de 4% laagsmeltende agarose in een petrischaaltje van drie centimeter dat op nat ijs is geplaatst om gelijkmatig af te koelen en te voorkomen dat de lob zinkt. Laat de agarose nog 30 seconden afkoelen en plaats de bijgesneden lob in het midden van de agarose, zodat deze in het midden van het blok kan bezinken. Snijd vervolgens de buitenranden van het agaroseblok af en maak het agaroseblok los van de schaal. Zorg ervoor dat de bovenzijde en de kant die op het Vibratome-platform is gelijmd, evenwijdig zijn aan de bovenrand van de lob. Begin met het instellen van de Vibratome om te snijden op een dikte van 250 micrometer met een snelheid van vijf en een frequentie van zeven hertz. Nadat je de Vibratome hebt gesteriliseerd en het dienblad op de Vibratome hebt geplaatst, omring je het met ijs om de omgeving koud te houden. Zet de messen in een neerwaartse hoek van 10 graden ten opzichte van het horizontale vlak. Vul vervolgens de Vibratome-tank met ijskoude Krebs-buffer. Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het platform om het voor te bereiden op de montage van het agaroseblok. Droog daarna de rand van het agaroseblok dat op het platform wordt gelijmd af met behulp van steriel absorberend weefsel. Plaats nu het agaroseblok op het verwijderbare platform van de Vibratome. Plaats de leverkwab rechtop om dwarse sneden mogelijk te maken, waardoor de druk op de lob wordt verminderd en het snijden soepeler wordt. Wacht een minuut totdat de lijm is uitgehard en dompel het platform onder in de Vibratome-tank, zorg ervoor dat het agaroseblok volledig bedekt is met Krebs-buffer. Om de Vibratome te programmeren voor het snijden, stelt u de start- en stopposities in. Begin vervolgens met het snijden van de plakjes totdat de leverkwab is bereikt. Gebruik een spatel om de leverschijfjes op te vangen, omdat dit schade voorkomt, in tegenstelling tot een tang of borstels. Verzamel de plakjes in ijskoude Krebs-buffer tot ze klaar zijn voor cultuur. Breng de leverschijfjes met behulp van een spatel over in de voorbereide putjes met media en inzetstukken. Plaats de platen vervolgens op een orbitale schudder die is ingesteld op 130 tpm en incubeer ze in een conventionele celcultuurincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof.