Karakterisering van gemedieerde extracellulaire elektronenoverdracht in melkzuurbacteriën met een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers

In ons laboratorium onderzoeken we extracellulaire elektronenoverdracht, of EET, in bacteriën zoals lactiplantibacillus plantarum, een fermentatieve bacterie die cruciaal is in de voedingsindustrie. In EET brengt de cel elektronen over naar een extracellulaire elektronische scepter, zoals een elektrode in een bio-elektrisch chemisch systeem. We willen EET begrijpen en engineeren voor toepassingen in biosensing, biokatalyse en voedselfermentatie.

We ontdekten dat alpentunnel stroom kan kopen via EET in aanwezigheid van chinon zoals DHNA. Dit proces regenereert NAD plus, versnelt het algehele verlies van de primaire fermentatieroutes en stimuleert de celgroei. Bovendien vinden we dat diverse chinonderivaten, anders dan DHNA, ook EET in L plantarum kunnen mediëren.

Het onderzoeken van gemedieerde EET vereist gespecialiseerde, biochemische opstellingen. Concreet gebruiken we een bio-elektrochemisch systeem met drie elektroden en twee kamers om overspraak tussen de anodische en de kathodische reacties te voorkomen. We gebruiken ook een werkelektrode met een koolstofveld en een groot oppervlak om de elektronenoverdracht van elektronenmediatoren te verbeteren.

Ons onderzoek naar EET-routes in L plantarum en hoe die routes interageren met het fermentatieve metabolisme kan nuttige toepassingen hebben in de voedingsindustrie. We weten dat EET en L plantarum de metabolische flux veranderen door fermentatie, en dat kan worden gemanipuleerd voor nuttige toepassingen en het veranderen van voedselaroma's en het produceren van waardevolle chemicaliën bij elektrofermentatie. In de toekomst zullen we onze fundamentele kennis van EET blijven vergroten en nieuwe EET-toepassingen nastreven in organismen zoals L plantarum.

We zijn van plan om eiwitten in de EET-route te ontwikkelen, waardoor we EET verder kunnen beheersen voor toepassingen in elektrofermentatie en biosensing. Schuur om te beginnen titaniumdraden met een diameter van één millimeter voor het werken in tegenelektroden, met aluminiumoxide schuurpapier tot het gelijkmatig glanzend is. Buig met een tang het ene uiteinde van elke werkende elektrodedraad in een kleine haak.

Schuif een ronde koolstofvilt van 16 vierkante centimeter op elke werkende elektrodedraad, weef de draad één keer in en uit de koolstofviltronde en trek de ronde langs de draad naar beneden totdat deze op de haak vastzit. Bevestig de werkende elektroden in GL 45-doppen door het rubberen septum met de draad te doorboren en een paar centimeter door te trekken. Om gepaarde reactoren te bouwen, monteert u de O-ring en plaatst u een voorgesneden kationenuitwisselingsmembraan, vooraf gedrenkt in water, in de geassembleerde O-ring.

Plaats de O-ring met het membraan tussen de grote bodemopeningen van twee gekoppelde reactorflessen. Zet de reactorpaarflessen en een ring vast met het membraan met een knokkelklem. Laat een magnetische roerstaaf in elke anodische kamer vallen voordat u alle kleine openingen aan de bovenkant van elke fles sluit met GL14-doppen, voorzien van rubberen septa.

Vul elke reactorfles met 110 milliliter gedeïoniseerd water. Plaats de doppen die zijn voorzien van een ronde werkelektrode van koolstofvilt en druk voorzichtig op de bovenkant van de vilten ronde om deze aan de haak vast te houden. Sluit de flessen af met de geschikte GL45-dop met elektrode.

Autoclaaf met water gevulde reactoren en GL14 elektrodekappen. Schraap onder steriele omstandigheden de lactoplant abasilisk plantarumcultuur van de bovenkant van een glycerolvoorraad en inoculeer in drie milliliter commerciële vraag rugosa sharp, of MRS-medium. Incubeer de cultuur een nacht bij 37 graden Celsius, zonder te schudden.

Gooi om te beginnen in een steriele bioveiligheidskast het geautoclaveerde water uit de reactoren van het bio-elektrochemische systeem weg. Vul de kathodische kamers met 110 milliliter geautoclaveerde M9 medium en anodische kamers met 110 milliliter vers bereide MCDM. Vervang een GL14-kap uit de anodische kamer door een autoclaaf GL14-kap met een siliconen plafondring.

Spuit de voorbereide referentie-elektroden in met 70% ethanol voordat u deze door de elektrodekap in elke anodische kamer plaatst. Draai alle doppen en klemmen vast om lekken te voorkomen. Om de reactoren aan het waterpompsysteem te bevestigen, plaatst u eerst elke reactor op het juiste roerstaafplatform.

Sluit vervolgens de watermantelkranen van elke reactor aan op de volgende met rubberen slangen en sluit de eindreactoren aan op de in- en uitstroombuizen van de waterpomp. Vul de pomp met water en voeg vier tot zes druppels waterconditioner toe. Zet het pompsysteem aan en stel de temperatuur in op 30 graden Celsius.

Start de pomp en observeer de waterstroom door alle watermantels van de reactor en bevestig dat er geen lekken zijn. Zet de roerplateaus aan en zet ze op continu roeren op 220 RPM. Om de reactoren aan de stikstofbesparende gasleidingen te bevestigen, bevestigt u eerst een luchtfilter aan een naald van 22 gauge en steekt u de naald door het bovenste septum van een anodische reactorkamer in de media.

Steek een naald van 18 gauge in het bovenste septum van de anodische kamer van een reactor, sluit vervolgens de gasleiding van een stikstofbron aan op het luchtfilter en open de klep zodat het gas voorzichtig door de reactor kan borrelen. Om de bioreactoren aan de potentiostaatdraden te bevestigen, sluit u de werkteller en de alligatorklemdraden van de referentie-elektrode van de potentiostaat aan op de overeenkomstige elektroden. Nadat u alle parameters hebt ingevoerd, drukt u op de groene startdriehoek om de run te beginnen.

Bekijk de sporen van de open circuitspanning gedurende een paar minuten om er zeker van te zijn dat alle reactoren positief lezen. en dicht bij elkaar met een constant signaal. Onder steriele omstandigheden subcultuur de eerder gekweekte L plantarumcultuur één tot 200 in 50 milliliter MMRS.

Laat de cellen een nacht groeien bij 37 graden Celsius, zonder te schudden. Haal om te beginnen de in MMRS gekweekte L plantarumcultuur uit de broedmachine. Breng de cultuur onder steriele omstandigheden over in een conische buis van 50 milliliter en plaats de buis op ijs.

Centrifugeer de cultuur bij 4.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het bovenstaande voordat u de pellet opnieuw suspendeert in 50 milliliter PBS. Na de tweede wasbeurt suspendeer je de cellen in koude PBS tot een optische dichtheid van 600 nanometer van 11.

Laad twee milliliter geresuspendeerde cellen in een spuit van drie milliliter, voorzien van een naald. Verwijder in het reactorstation een celspuit en steek de naald in de bovenkant van de anodische kamer van een reactor. Zodra alle spuiten op hun plaats zitten, drukt u de zuigers in om de cellen te injecteren.

Noteer het tijdstip van injectie aan de hand van het chronoamperometriespoor. Laat de stroom twee tot vier uur op het spoor stabiliseren. Label in het bio-elektrochemische systeem de experimentele reactoren als plus DHNA en de oplosmiddelcontrolereactoren als minus DHNA.

Verwijder het sluitpunt van een spuit gevuld met 110 microliter van 20 milligram per milliliter DHNA en steek deze in de bovenkant van de anodische kamer, aangeduid als plus DHNA. Steek een spuit gevuld met 110 microliter DMSO in de anodische kamer, aangeduid als minus DHNA. Gebruik een spuit van drie milliliter voorzien van een naald van 21 gauge en verwijder twee milliliter media uit elke anodische kamer door het ongebruikte septum met kleine dop.

Breng de monsters over naar een plaat met 24 diepe putten om de pH te meten voor het nuluurtijdstip. Druk de zuigers van DHNA- en DMSO-spuiten in om in de reactoren te injecteren. Noteer het tijdstip van injectie aan de hand van het chronoamperometriespoor.

Gooi alle spuiten en naalden weg. Verwijder na 24 uur twee milliliter media uit elke anodische kamer zoals eerder beschreven, en breng deze over naar een plaat met 24 diepe putten voor 24-uurs pH-metingen. Voer de cyclische voltammetrie uit voor het 24-uurs tijdstip.

Meet en registreer de pH voor de 24-uurs monsters van elke reactor. De stroomdichtheid als gevolg van extracellulaire elektronenoverdracht bereikte acht uur na de DHNA-injectie een piek van ongeveer 132 microampère per vierkante centimeter. De DMSO-injectie daarentegen resulteerde in een verwaarloosbare stroomdichtheid.

De cyclische voltammetriegegevens toonden een duidelijke toename van de oxidatieve stroom bij 50 millivolt in aanwezigheid van L plantarum met DHNA, vergeleken met L plantarum met DMSO en een toename van 256% in stroomdichtheid bij 300 millivolt, vergeleken met het abiotische DHNA-spoor. Extracellulaire elektronenoverdracht resulteerde in een opmerkelijke daling van de pH tot een gemiddelde van 3,33 gedurende 24 uur in de monsters met L plantarum en DHNA, terwijl de monsters met L plantarum en DMSO een gemiddelde pH van 6,50 hadden.