Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Ons onderzoek richtte zich op het gebruik van complexe polymicrobiële modellen om de complexe interacties tussen microben in de cystische fibrose-omgeving te begrijpen en hoe dit resulteert in verhoogde antimicrobiële tolerantie. We hopen deze kennis te gebruiken om nieuwe therapeutische interventies te ontwikkelen. Vooruitgang op het gebied van biofilm wordt gedreven door visualisatie, in combinatie met kwantificeringsmethodologieën naast biofysische benaderingen.

Dit omvat technieken zoals 3D OrbiSIMS die ruimtelijke resolutie tot op micro- en nanoschaal geven. Dit onderzoek heeft tot doel een polymicrobieel model te creëren dat een niveau van complexiteit handhaaft, representatief voor wat wordt gezien bij de antibioticabehandelingen bij CF-patiënten. Het zorgt ook voor een hogere doorvoer, meer relevante outputs en aanpassingsvermogen aan andere stammen en omstandigheden.

Dit protocol biedt een relevante testomgeving voor CF-pathogenen. Het is robuust en heeft een relatief hoge doorvoer. Het is ook vatbaar voor meerdere eindpunten, waardoor complexere onderzoeken kunnen worden uitgevoerd.

Dit onderzoek heeft aangetoond dat een omgeving die relevant is voor CF de microbiële gevoeligheid verandert. Bovendien kan het type schimmels dat aanwezig is ook de gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa veranderen, en dit kan significant klinisch relevant zijn. Neem om te beginnen culturen van Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans die tot de exponentiële fase zijn gegroeid.

Breng met behulp van een micropipet één milliliter van elke vloeibare cultuur over in een afzonderlijke steriele buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buisjes gedurende twee minuten op 8.000 x g om de bacteriën of schimmels te pelleteren. Zuig daarna met behulp van een pipet het bovenstaande uit elke buis op en suspendeer de pellets opnieuw in één milliliter PBS.

Verdun de geresuspendeerde cellen Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus één tot 10 in PBS. Meet vervolgens met behulp van een spectrofotometer de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nanometer. Na het verdunnen van de gewassen monsters van Candida albicans één tot 100 in PBS, pipetteer 10 microliter van elk monster in twee individuele kamers van een hemocytometer.

Stel vervolgens het Candida albicans monster in op 1 x 10 tot de macht acht CFU per milliliter in PBS. Om het inoculum voor te bereiden op toevoeging aan de biofilm, past u het inoculum van de Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans en Staphylococcus aureus aan met behulp van PBS. Voor biofilms van monospecies pipetteert u 10 microliter van de verdunde microbe op het midden van een schijf van polycarbonaat die op de SCFM2 1,5% technische agar in platen met 6 putjes is geplaatst.

Incubeer de plaat statisch bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur vóór de behandeling of verstoring. Voeg voor polymicrobiële biofilms 10 microliter van elke Staphylococcus aureus en Candida albicans toe op dezelfde polycarbonaat schijf. Incubeer de geënte schijf statisch gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Breng na incubatie met een steriele tang de polycarbonaatschijven over op verse SCFM2 1,5% technische agarplaten. Voeg 10 microliter van de 1 x 10 toe aan de kracht van vier CFU per milliliter verdunning van Pseudomonas aeruginosa bovenop de vooraf vastgestelde Staphylococcus aureus, Candida albicans biofilm. Incubeer nog 24 uur bij 37 graden Celsius.

Neem om te beginnen een biofilm van een vaste luchtinterfacekolonie van Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans. Voeg keramische kralen met een diameter van 2,8 millimeter toe aan de plaat en UV crosslink de plaat. Breng met behulp van een met vlammen gesteriliseerde tang vijf keramische kralen over in een steriele homogenisatorbuis van twee milliliter.

Pipetteer een milliliter PBS in de homogenisatiebuis van twee milliliter. Draai de buizen gedurende ten minste 10 seconden of totdat de biofilm van de polycarbonaatschijf is verwijderd, zoals bepaald door visuele inspectie. Eenmaal verwijderd, haalt u de schijf van polycarbonaat eruit, plaatst u de buizen met de kralen in de homogenisator en klopt u ze twee keer gedurende 10 seconden met zes meter per seconde met een interval van tien seconden tussen de beats.

Giet nu de verstoorde biofilm uit de homogenisatorbuis in een bijou van zeven milliliter met vier milliliter PBS, wat resulteert in een eindvolume van vijf milliliter. Centrifugeer de homogenisatorbuizen gedurende twee minuten bij 8.000 x g. Breng vervolgens de resterende vloeistof over naar de bijou van zeven milliliter om ervoor te zorgen dat alle vloeistof wordt overgebracht.

Voeg 200 microliter van de verstoorde biofilm toe aan een zwarte plaat met 96 putjes met heldere bodem en pipetteer vervolgens 10 microliter 0,02% resazurine-oplossing in elk putje. Incubeer de met resazurine behandelde biofilm in een plaatlezer bij 37 graden Celsius. Pas orbitaal schudden elke 30 minuten gedurende 10 seconden toe bij 200 RPM voordat u fluorescerende metingen uitvoert.

Meet de fluorescentie met behulp van een excitatiegolflengte van 540 nanometer en een emissiegolflengte van 590 nanometer. Mono-species biofilms vereisten significant lagere concentraties meropenem en tobramycine om 50% doding te bereiken in vergelijking met polymicrobiële biofilms, met een toename van twee log in antibioticaconcentratie die nodig is voor de laatste. De overleving van Pseudomonas aeruginosa nam toe in polymicrobiële biofilms met 64 microgram per milliliter tobramycine, terwijl meropenem een afname van de overleving vertoonde onder vergelijkbare omstandigheden.

In mono-species biofilms werd een sterke correlatie waargenomen tussen de overleving van Pseudomonas aeruginosa en de metabolische activiteit ervan bij behandeling met zowel meropenam als tobramycine.