Kwantificering van door diabetes geïnduceerde adherente leukocyten in retinale vasculatuur

De focus van het onderzoek in ons laboratorium is om erachter te komen wat retinopathie bij diabetes veroorzaakt en hoe dit kan worden voorkomen. Verschillende laboratoria hebben aangetoond dat de leukostase, de overaccumulatie van witte bloedcellen, in de kleine bloedvaten van het oog diabetes verhoogt. En dit kan bijdragen aan de occlusie en degeneratie van de bloedvaten in het netvlies bij diabetes. Deze techniek maakt het mogelijk om de ernst van de leukostase in het retinale vaatstelsel te visualiseren en te kwantificeren. En het kan worden gebruikt in de onderzoeken die de werkzaamheid van verschillende therapieën, waaronder medicijnen, willen evalueren.

[Docent] Om de drukzetter in te stellen, sluit u de 0,9% zoutoplossing zak in serie aan. de intraveneuze katheterset, een vierwegklep en de maagdsondenaald. Open het perfusiesysteem en spoel de leidingen en poorten gedurende twee minuten door met zoutoplossing met een debiet van 18 tot 20 milliliter per minuut om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de verdoofde muis in rugligging op de perfusiefase. Identificeer het xiphoid-proces visueel. Met de hemostaat in de dominante hand, zet u de huid vast en vergrendelt u deze. Breng vervolgens de hemostaat over naar de niet-dominante hand en til de huid op. Knip vervolgens met een schaar een stukje huid af in een hoek van 90 graden ten opzichte van de wervelkolom om de buitenste buikwand bloot te leggen. Met de processus xiphoid en de ribbenkast zichtbaar, ontleedt u bilateraal door de buikwand, waarbij u zorgvuldig organen of grote bloedvaten vermijdt. Visualiseer nu de hartventrikels en longen door het middenrif. Maak met behulp van de schaarpunt een incisie in het middenrif aan één kant bij de wervelkolom. Leg het hart bloot in de borstholte na het doorsnijden van het borstbeen. Met een tang in de niet-dominante hand pak je het hart vast bij de top. Houd met de dominante hand de gavagenaald vast die aan de intraveneuze katheter is bevestigd en prik de top van het hart door. Zorg ervoor dat de kogelpunt van de sondenaald iets uit de prikplaats steekt om te voorkomen dat de linkerventrikel volledig wordt geperforeerd of in het longvaatstelsel terechtkomt. Open vervolgens de kraan om de stroom van 0,9% zoutoplossing mogelijk te maken. Gebruik tegelijkertijd een schaar om het rechter atrium open te knippen. Ga door met perfusie gedurende twee tot drie minuten, beweeg de naald voorzichtig heen en weer en op en neer om knikken van het vaatstelsel te voorkomen en de bloedafvoer uit het hart te vergroten. Draai na perfusie aan de kraan om de zoutoplossing af te sluiten en laat de spuit van de spuit naar de sondenaald stromen. Perfuseer vervolgens handmatig 10 milliliter concanavalin A-oplossing binnen 30 tot 35 seconden. Nadat u het hart van een verdoofde muis hebt doorgebloed met concanavalin A-oplossing, draait u de muis op zijn zij. Plaats de wijsvinger van de niet-dominante hand op het bovenste ooglid en de duim op het onderste ooglid. Trek de oogleden en de omliggende huid voorzichtig terug om het oog te proptoseren, zodat het gedeeltelijk uit de oogkas kan uitpuilen. Gebruik vervolgens de gebogen schaar in de dominante hand en schep onder het oog in een hoek van 45 graden. Snijd de spieraanhechtingen en de oogzenuw door. Gebruik de schaar als spatel om het oog over te brengen naar een klein bakje. Plaats het oog op tandwas om je voor te bereiden op het openen van de bol. Houd onder de ontleedmicroscoop met behulp van een microtang de scleraatplooi of spierresten vast die aan de achterkant van het oog zijn bevestigd en richt het oog zo dat het hoornvlies naar één kant wijst. Maak een incisie achter en evenwijdig aan de limbus. Gebruik een microschaar om het voorste segment van het oog te scheiden, inclusief de lens rond de omtrek van de oogschelp, zodat het netvlies volledig loskomt van de sclera. Schep het netvlies uit de sclera met de microspatel. Als het netvlies nog steeds vastzit aan de oogzenuw, steek dan een microschaar tussen het netvlies en de sclera om de oogzenuw door te snijden. Plaats het niet-gefixeerde netvlies op een dia met een druppel PBS. Maak vier tot vijf radiale sneden in het netvlies, waardoor een klaverbladpatroon ontstaat zodat het plat ligt. Bekijk het plat gemonteerde netvlies onder de microscoop met een vergroting van 100x met behulp van een 10x objectief. Fluorescerende microscopie van het retinale vaatstelsel toonde aan dat diabetische netvliezen milde leukostase vertoonden met doorgaans 3 tot 12 leukocyten per netvliezen vergeleken met 1 tot 3 bij niet-diabetische controles. Significante leukocytenclusters werden waargenomen in inflammatoire modellen met lipopolysacchariden, in tegenstelling tot de milde clustering in diabetische monsters.