Schaalbare bioproductieworkflow voor het produceren en isoleren van Natural Killer-cellen afgeleide extracellulaire kankerbiotherapeutica op basis van vesikels

Ons onderzoek richt zich op kleine blaasjes die worden geproduceerd door een type immuuncellen die van nature effectief zijn in het doden van kankercellen. Deze blaasjes hebben een veelbelovend therapeutisch potentieel voor de behandeling van solide tumoren, zowel op de primaire als op de secundaire plaatsen zoals de hersenen. In deze studie gebruiken we een bimodale hars om blaasjes te isoleren via chromatografie met uitsluiting van grootte, waarbij de productzuiverheid wordt gemaximaliseerd door de blaasjes fysiek te scheiden van verontreinigingen en tegelijkertijd verontreinigingen in de hars verder op te vangen door middel van elektrostatische krachten.

Vervolgens steriliseren, concentreren en bufferen we de blaasjes voor gebruik De details van de bioproductieworkflow in deze video maken gebruik van klinisch relevante omstandigheden en zijn schaalbaar voor kosten, waardoor effectief grote hoeveelheden extracellulaire blaasjes met een hoge zuiverheid worden geproduceerd. Dit maakt de techniek toegankelijk voor academische laboratoria om vol vertrouwen middelen te investeren in het bestuderen van dergelijke therapieën met een betrouwbaar productie- en isolatieproces. We onderzoeken momenteel het therapeutisch potentieel van deze blaasjes en preklinische modellen en versterken ons begrip van hoe ze werken verder.

Voer om te beginnen een snelle start van het vloeistofchromatografiesysteem voor eiwitten uit volgens de instructies van de fabrikant. Maak verbindingen met behulp van de druppel-tot-druppel-methode om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de kolom wordt gebracht. Stel de fractiecollector in met de juiste verzamelbuisjes om de monsters te verzamelen.

Wijzig de fractioneringsinstellingen in het gewenste inzamelvolume. Haal 40 tot 80 milliliter eerder bereid extracellulair blaasje of EV-rijke geconditioneerde media uit de vriezer van 80 graden Celsius en ontdooi snel bij 37 graden Celsius. Draai het monster gedurende 30 minuten bij 10.000 G bij vier graden Celsius en breng het bovenstaande over in een nieuwe buis.

Om dubbelstrengs DNA-niveaus te verlagen, behandelt u de EV-rijke geconditioneerde media met vijf millimol magnesiumchloride en 50 eenheden per milliliter endonuclease. Incubeer het monster gedurende twee tot vier uur bij 37 graden Celsius met matige menging. Zodra het chromatografiesysteem klaar is, laadt u de EV-rijke geconditioneerde media in een spuit van 60 milliliter en sluit u deze aan op de monsterlijn.

Klik op Handmatig uitvoeren om het systeem te starten en stel het debiet in op nul. Volg de aanwijzingen van de software om de run preventief op te slaan. Klik vervolgens op Start.

Selecteer Line Beat Double-Filtered PBS en draai met een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut, zodat de oplossing door de kolom loopt. Zodra het absorberende middel stabiliseert, drukt u op Auto Zero UV. Verander het stroompad om het monster naar de afvalfles vóór de kolom te leiden. Richt het monster na vijf tot 20 seconden op de kolom.

Zodra de UV-metingen ongeveer 230 milliabsorptie-eenheden bereiken, klikt u op Fractionering. Na volledige injectie van het monster schakelt u het buffersysteem over op dubbel gefilterd PBS om de zuivering voort te zetten. Wanneer de UV-waarde ongeveer 1.600 milliabsorptie-eenheden bereikt, klikt u opnieuw op Fractionering.

Zodra de run is gestopt, slaat u het chromatogram op als een PDF-document. Spoel elk onderdeel van het ultrafiltratieapparaat met 20 tot 30 milliliter 90% ethanol. Draai vijf tot 10 minuten op 4.000 G en gooi de stroom weg.

Voer vervolgens de spoeling uit met steriel PBS om het apparaat in evenwicht te brengen en herhaal de centrifugatiestappen zoals voorheen. Combineer alle verdunde fracties van NK-EV's. Om de steriliteit te maximaliseren, filtreert u de verdunde NK-EV-oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 micrometer, voorbevochtigd met dubbel gefilterd PBS.

Verzamel het filtraat in het gesteriliseerde concentratieapparaat. Draai het filtraat op 4.000 G gedurende 15 tot 40 minuten. Meng na het centrifugeren de oplossing in het bovenste filtercompartiment met behulp van een serologische pipet.

Draai opnieuw gedurende 10 minuten op 4.000 G. Keer het filterapparaat om en bevestig het aan het opvangapparaat om de NK-EV op te vangen. Draai de NK-EV gedurende twee minuten op 2.000 G en breng het gezuiverde product over in een steriele buis.

Start het analysesysteem voor het volgen van nanodeeltjes volgens de instructies van de fabrikant. Let op luchtbellen in de stroomcel. Als er een luchtbel aanwezig is, verwijder deze dan door de flowcel te spoelen met 20%ethanol en dubbel gefilterd water.

Zodra dit is gewist, plaatst u de lasermodule voorzichtig terug in het analyse-instrument voor het volgen van nanodeeltjes. Sluit de deur en klik op Camera starten. Wijzig de opname-instellingen in een schermversterking van twee en een cameraniveau van 14.

Zet de verwarming aan om de temperatuur te stabiliseren van de stroomcel. Klik op Standaardmeting om een script te maken onder het tabblad SOP voor het verzamelen van één opname gedurende een minuut met een debiet van 30 bij 23 graden Celsius. Voeg de map en bestandsnaam toe aan de naam van het pad om de gegevens op te slaan.

Vortex het gezuiverde NK-EV-product en bereid de verdunning ervan met behulp van dubbel gefilterd PBS. Nadat u het verdunde monster hebt gevortext, laadt u het in de acquisitiespuit van 1 milliliter zonder luchtbellen te introduceren. Sluit de spuit voorzichtig aan op de laadleiding van het instrument.

Duw langzaam de helft van het monster en laat ongeveer 0,5 milliliter in de spuit. Zodra deeltjes zichtbaar zijn op het scherm, stelt u de camera scherp om maximaal één halo rond elk deeltje te hebben, Klik onder het tabblad Hardware op Infuse en stel een snelheid in van 1.000 gedurende vijf seconden. Verlaag vervolgens het tarief naar 30.

Druk op Script uitvoeren. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de instellingen correct zijn, klikt u op Ja en volgt u de aanwijzingen van de software. Nadat u de opname hebt voltooid, klikt u op Annuleren wanneer de software vraagt om bestanden te verwerken of te exporteren.

Na het registreren van vijf vangsten per verdunning, importeert u alle vijf de vangsten voor analyse. Markeer de bestanden en klik op Geselecteerde bestanden verwerken. Pas op het tabblad Proces de analyse-instellingen aan op een schermversterking van twee en een detectiedrempel van 15.

Vink deze optie aan en klik op OK voor analyse. Klik na verwerking op Ja zonder op extra vakjes te klikken of klik op Exporteren om de bestanden te exporteren. De deeltjesgrootte van gezuiverde NK-EV varieerde van 76,30 tot 174,30 nanometer met een gemiddelde concentratie van 1,39 keer 10 tot de macht van 12 EV's per milliliter.

Bovendien toonde de kwantificering van de fluorometer een eiwitconcentratie van ongeveer 300 milligram per milliliter en een dubbelstrengs DNA-concentratie van 225 milligram per milliliter. Behandeling met menselijke K562-leukemiecellen met NK-EV's toonde een dosisafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van de cellen met een EC 50 van 9,33 keer 10 tot de macht van negen EV's per milliliter.