Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen
20 september 2024
Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.
Van weefsel afgeleide exosomen hebben steeds meer aandacht getrokken vanwege hun vermogen om weefselspecificiteit en de micro-omgeving nauwkeurig weer te geven. Ons onderzoek richtte zich op het achterhalen van de basale en translationele rollen van milt-afgeleide exosomen bij hart- en vaatziekten. In deze studie ontwikkelen we een praktisch protocol voor het isoleren van exosomen uit miltweefsels van muizen, waardoor een reproduceerbare techniek wordt geboden voor daaropvolgende identificatieanalyse en functionele studies.
We gebruiken een Type I collagenase voor de spijsvertering, gevolgd door filtratie door middel van differentiële ultracentrifugatie om miltexosoom van hoge kwaliteit te verkrijgen. In tegenstelling tot eerdere rapporten, waarbij weefselhomogenisatie wordt gebruikt om weefselsuspensie te verkrijgen, behoudt onze aanpak de membraanintegriteit van cellen in weefsels. Deze techniek zou bijzonder nuttig kunnen zijn bij het bestuderen van de rol van exosoom in immuunresponsen.
Gezien de kritieke functie van de milt in het immuunsysteem, zouden toekomstige studies dit protocol kunnen aanpassen aan menselijke weefsels, waardoor de extractie van klinisch relevant exosoom voor diagnostische en therapeutische doeleinden mogelijk wordt. Koel om te beginnen de high-speed en ultra-high-speed centrifuges voor tot vier graden Celsius en stel de temperatuur van de desktopshaker in op 37 graden Celsius. Bereid de celkweekschaaltjes met een diameter van 100 millimeter voor.
Plaats vervolgens 50 milliliter steriele centrifugebuisjes, ijs en steriele celzeven met een diameter van 70 micrometer. Spuit 75%alcohol om de schaar en tang te steriliseren en verwarm ze op hoge temperatuur om verder te steriliseren. Plaats vervolgens het miltweefsel in een steriele petrischaal van 100 millimeter op ijs en spoel het oppervlaktebloed af met koude 1X PBS.
Droog de milt grondig af met steriel gaas voordat u de tissues weegt. Voeg vervolgens met behulp van een steriele transferpipet een milliliter PBS toe aan een celzeef van 70 micrometer om deze te bevochtigen. Bereid ten slotte 0,1%Type I collagenase in 1X PBS met een vortexmixer om de verteringsbuffer te verkrijgen.
Bereid om te beginnen de reagentia en de steriele hulpmiddelen voor weefselverwerking voor. Hak met een schaar het miltweefsel in kleine, uniforme stukjes in een kweekschaaltje op ijs en breng ze over in een centrifugebuis van 50 milliliter met behulp van een steriele transferpipet. Voeg vervolgens de spijsverteringsbuffer toe aan de buis op basis van het gewicht van het miltweefsel en schud de buis in een hoek van 45 graden op een horizontale shaker die is ingesteld op 37 graden Celsius.
Stop de spijsvertering wanneer de weefselbrokken zich hebben verspreid en de meeste stukjes hun vorm hebben verloren. Breng het verteerde mengsel over door een celzeef van 70 micrometer bij kamertemperatuur om vezelachtige en grotere weefselresten te verwijderen. Vang het filtraat op in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter.
Centrifugeer het filtraat bij 500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng vervolgens het supernatans over in een nieuwe buis en herhaal de centrifugeerstap met de juiste snelheden. Gooi na ultracentrifugatie het supernatans weg en was de pellet met PBS.
Ultracentrifugeer opnieuw bij 120.000 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius om de exosomen te isoleren. Los ten slotte de geïsoleerde exosomen op in 200 microliter steriele PBS per milt en bewaar ze in een centrifugebuis van twee milliliter bij min 80 graden Celsius. Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden onthulden de aanwezigheid van komvormige blaasjes met een lipidedubbellaag, kenmerkend voor exosomen.
Exosoomgroottes varieerden van 30 tot 150 nanometer met een piekconcentratie van 60 nanometer, zoals weergegeven in de grafiek van de grootteverdeling. Western blot-analyse bevestigde de aanwezigheid van exosomale markers, TSG101 en CD9, terwijl GM130 en negatieve controle niet werden gedetecteerd.
Overzicht
Deze studie presenteert een praktisch protocol voor het isoleren van exosomen uit muis miltweefsel, wat cruciaal is voor het begrijpen van hun rol bij hart- en vaatziekten. De methode combineert collagenase type I-digestie met ultracentrifugering, wat zorgt voor een hoge kwaliteit exosome opbrengst terwijl de integriteit van het celmembraan behouden blijft.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
Achtergrond
- Uit weefsel afkomstige exosomen weerspiegelen weefselspecificiteit en micro-omgeving.
- Milt-afkomstige exosomen spelen een rol in immuunresponsen.
- Het begrijpen van de functie van exosomen is essentieel voor onderzoek naar hart- en vaatziekten.
- Vorige methoden kunnen de membraanintegriteit in gevaar brengen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol te ontwikkelen voor het isoleren van milt-afkomstige exosomen.
- Om de daaropvolgende identificatieanalyse en functionele studies te vergemakkelijken.
- Om het begrip van de rol van exosomen bij hart- en vaatziekten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Digestie van miltweefsel met behulp van collagenase type I.
- Filtratie door differentiële ultracentrifugering.
- Isolatie van hoge kwaliteit exosomen.
- Behoud van de integriteit van het celmembraan tijdens het proces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van milt-afkomstige exosomen.
- Hoge kwaliteit exosomen geschikt voor verdere analyse.
- De methode toont verbeterde behoud van de membraanintegriteit.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van immuunresponsen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het isoleren van exosomen uit muismilt.
- Deze techniek kan het onderzoek naar de functies van exosomen bij hart- en vaatziekten verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken voor verschillende toepassingen in de immunologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
