Modellering van de endotheliale glycocalyx na pneumonectomie in een 3D-fluïdische chip - een benadering voor het fabriceren van een vasculair orgaan-op-chip-systeem

Het Mensah Lab richt zich op vasculair onderzoek en ontwikkelt nieuwe technieken voor het onderzoek naar de endotheliale glycocalyx en de rol daarvan bij vaatziekten. Recente ontwikkelingen zijn het creëren van meer geavanceerde in vitro modellen voor glycocalyxonderzoek en het onderzoeken van therapeutische strategieën om de gezondheid en het herstel van endotheliale glycocalyx bij ziekten aan te pakken. Experimentele uitdagingen zijn onder meer onvolledige in vitro-modellen, die er niet in slagen gezonde glycocalyx nauwkeurig te repliceren, evenals moeilijke kwantificerings- en meettechnieken.

Onze huidige bijdrage aan het veld heeft het huidige begrip van de endotheliale glycocalyx uitgebreid, met name in zijn rol bij kankermetastase, regeneratie van beschadigde glycocalyx en interacties met vasculaire oppervlaktereceptoren. Onze methode biedt een goedkope en effectieve methode voor het creëren van organ-on-a-chip vasculaire systemen die meer ontwikkelde en biomimetische endotheliale glycocalyx tot expressie brengen in vergelijking met conventionele technieken. Weeg om te beginnen 10 delen siliconen elastomeer basis af in een centrifugebuis van 50 milliliter.

Giet een deel uithardingsmiddel in de tube met de siliconen elastomeerbasis tot een eindvolume van 30 milliliter. Meng grondig om een uniforme oplossing te verkrijgen. Giet nu de goed gemengde oplossing in de vormpjes en plaats de vormpjes vervolgens in een vacuümkamer om het PDMS 30 tot 60 minuten te ontgassen of totdat er geen luchtbellen meer zijn.

Haal het ontgaste PDMS uit de vacuümkamer en laat het 48 uur uitharden bij kamertemperatuur. Haal de uitgeharde PDMS uit de PLA-mal. Plaats vervolgens twee stukken dubbelzijdig plakband in elke celkweekplaat.

Plaats vervolgens elk PDMS-vaatstelsel half op de tape in zijn eigen celkweekschaaltje. Breng met een micropipet meerdere druppels fibronectine van 30 microliter langs het PDMS-vaatstelsel aan. Kantel het PDMS naar behoefte en gebruik een pipetpunt om het oppervlak gelijkmatig te bedekken.

Zuig na een incubatie van 30 minuten de fibronectine-oplossing op uit de PDMS. Laat de stukjes vervolgens aan de lucht drogen in de kast. Plaats 3D-geprinte pluggen aan elk uiteinde van de PDMS-vaatstelselhelften om lekkage van de celsuspensie te voorkomen, met behulp van twee pluggen per stuk.

Zaai met een micropipet 300 microliter HLMVEC-celsuspensie in elk PDMS-stuk en incubeer. Plaats vervolgens de helften terug in de kast en verwijder de vier pluggen. Voeg HLMVEC-kweekmedium toe om de PDMS-vaatstelselhelften onder te dompelen en incubeer opnieuw gedurende zes tot 10 uur.

Zuig nu de HLMVEC-media op uit de petrischaal met de vaatstelselhelften. Plaats elke PDMS-helft in de polycarbonaatblokken en zorg voor een goede uitlijning. Breng siliconenkit aan op de uiteinden van het PDMS-vaatstelsel.

Steek een centimeterlange slang in beide uiteinden van het onderste PDMS-stuk. Draai vervolgens het bovenste acrylblok met de bovenste PDMS-helft om op het onderste acrylblok. Schroef de acrylblokken aan elkaar en zorg ervoor dat het schroefdraadblok aan de onderkant zit.

Sluit de vrije uiteinden van de slang af met behulp van 3D-geprinte pluggen. Verwijder een plug en injecteer voorzichtig 500 microliter HLMVEC-kweekmedium in het vaatstelsel met behulp van een micropipet. Kantel om luchtbellen te verwijderen en plaats vervolgens de plug terug.

Breng de geassembleerde chip en steriele componenten naar de bioveiligheidskast. Sluit alle slangen aan en monteer het stroomsysteem, waarbij u ervoor zorgt dat de inlaatslang aansluit op de bodem van het spuitreservoir om de zwaartekrachtstroom te vergemakkelijken. Vul het stroomsysteem nu voorzichtig voor met HLMVEC-medium.

Gebruik een serologische pipet van 50 milliliter. Injecteer 30 milliliter medium in de bovenkant van het spuitreservoir en laat de peristaltische pomp op lage snelheid werken om de slangen te vullen. Was elke PDMS-vaatstelsel voor de helft in PBS gedurende vijf minuten en voeg voldoende oplossing toe om het vaatgedeelte volledig onder te dompelen.

De vloeistofsimulatie toonde significant verhoogde schuifspanning bij vaatvertakkingen in het pneumonectomiemodel in vergelijking met het controlemodel. Brightfield-microscopie bevestigde een uniforme HLMVEC-celaanhechting in zowel statische als flow-omstandigheden met 93,1 milliliter per minuut na 24 uur. Fluorescentiebeeldvorming van de inlaatbifurcatie toonde intacte en goed verdeelde cellagen in zowel controle- als pneumonectomiemodellen.

Beeldvorming onmiddellijk na de tweede bifurcatie toonde aanzienlijk celverlies in zowel het controle- als het pneumonectomiemodel. Cellen bleven aanhankelijk en vertoonden consistente kleuring in het gebied stroomafwaarts van de tweede bifurcatie in beide modellen. Uniforme DAPI-gekleurde kernen in de vasculaire modellen gaven aan dat de samenvloeiing behouden bleef ondanks blootstelling aan stroming.

Een vroege proef met controlemodellen resulteerde in een ongelijke celverdeling als gevolg van luchtbellen die tijdens de priming van het systeem werden geïntroduceerd.