Name: Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Leer een gevalideerd protocol voor kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen met digitale druppel-PCR. Deze methode verbetert de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van AAV-titerbepalingen in virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Gestandaardiseerd protocol voor kwantificering van het virale genoom met behulp van digitale druppel-PCR

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Gimpel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+process+and+product+characterization+of+recombinant+adeno-associated+virus-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 20, 740-754 (2021).</li>
<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
<li>Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobnik%2C+D+%22Front+Microbiol%22">Front Microbiol</a>. 10, (2019).</li>
<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8-kanaals pipette 10 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>8-kanaals pipette 200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>8-kanaals pipette 300 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>8-well PCR strip</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler met 96&ndash;Deep Well Reactie Module</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Buffer Control voor Probes 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Platen (pakket van 25)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Olie (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridge Holder</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges voor QX200/QX100 (pakket van 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets voor QX200/QX100 (pakket van 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro;L) + buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Generation Olie voor Probes (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0,1-10 &mu;L, 34 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 &mu;L, 55 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 2-100 &mu;L, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERIEL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Forward gelyofiliseerd primers en respectieve master stocks bij 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als doelsequentie. Forward primer: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'</td></tr><tr><td>Lyofilisaat sonde en master stock bij 100 &micro;M&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als doelsequentie. PrimeTime Eco Sonde: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, folie, doorboorbaar (pakket van 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 niet-ionogene oppervlakteactieve stof (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Chloride (KCl)</td><td>Honeywell research chemicals</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX manager software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software om ddPCR data te analyseren</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoir</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Reverse gelyofiliseerd primers en respectieve master stocks bij 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP als doelsequentie. Reverse primer: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'</td></tr><tr><td>SafeSeal reactiebuis, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA, gescheurd (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>IDT</td><td></td><td>Bij bestelling samen met primers</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

quantification-adeno-associated-viral-genomes-purified-vector-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Dit manuscript details een eenvoudig punt vlek assay voor kwantificatie van adeno-associated virus (AAV) titers en de toepassing ervan op het bestuderen van de rol van de vergadering-activeren eiwitten (AAPs), een nieuwe klasse van niet-structurele virale eiwitten gevonden in alle AAV serotypen, bij het bevorderen van de vergadering van capsids afgeleid van cognaat en heterologe AAV serotypen.

Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

Dit protocol presenteert hoe AAV-transductie-efficiëntie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van digitale druppel PCR (dd-PCR) samen met kleinschalige AAV-productie, intravitreale injectie, retinale beeldvorming en retinale genomische DNA-isolatie.

Digitale druppel PCR-methode voor de kwantificering van AAV-transductie-efficiëntie in murine retina

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van goede laboratoriumpraktijken in de conforme detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in menselijke tranen door druppel digitale polymerasekettingreactie ter ondersteuning van de klinische ontwikkeling van gentherapievectoren.

Een valideerbare druppel digitale polymerasekettingreactietest voor de detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in biosheddingstudies van tranen

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor laterale staartaderinjectie bij muizen om adeno-geassocieerd virus (AAV) systemisch toe te dienen bij volwassen muizen. Daarnaast beschrijven we protocollen van veelgebruikte assays om AAV-transductie te beoordelen.

Consistente toediening van adeno-geassocieerd virus via laterale staartaderinjectie bij volwassen muizen

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Nauwkeurige, causaliteit kwantificering van de wereldwijde diastolische functie is bereikt door kinematische-modeling gebaseerde analyse van transmitraal stroom via de Geparameteriseerde diastolische Vullen (PDF) formalisme. PDF genereert unieke stijfheid, ontspanning, en de belasting parameters en belicht 'nieuwe' fysiologie, terwijl het verstrekken van gevoelige en specifieke indexen van disfunctie.

Kwantificering van Global diastolische functie door Kinematisch Modeling-gebaseerde analyse van transmitraal Flow via de Geparameteriseerde diastolische Vullen formalisme

Verbeterde donkerveldmicroscopie en hyperspectraal beeldvorming met spectraal mapping maken screening, lokalisatie en identificatie van nanoschalige materialen in histologische monsters mogelijk met verbeterde snelheid en nauwkeurigheid ten opzichte van traditionele methoden. Het doel van dit artikel is om methoden te bieden voor donkerveld beeldvorming en hyperspectraal mapping van metaaloxide nanodeeltjes in histologische monsters.

Identificatie van Metal Oxide Nanodeeltjes in histologische monsters door Enhanced Darkfield Microscopie en hyperspectrale Mapping

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Leer een gevalideerd protocol voor kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen met digitale druppel-PCR. Deze methode verbetert de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van AAV-titerbepalingen in virologisch onderzoek.

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Meer video's verkennen