Optimalisatie van antigeenpreparaat voor hemagglutinatie-inhibitietest van Newcastle Disease Virus-serologie

Ons onderzoek richt zich op het optimaliseren van de antigeenpreparaat voor de hemagglutinatie-inhibitietesten. Om de nauwkeurigheid van de detectie van NDV-antilichamen te verbeteren, bieden we een methode voor de snelle en nauwkeurige bereiding van de 4-HAU-antigeenoplossing. De HI-test blijft de meest gebruikelijke methode voor de detectie van NDV-antilichamen.

Nieuwe technologieën, waaronder geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen, serologische platforms met hoge doorvoer en de geavanceerde beeldvormingstools kunnen echter ook in de HI-test worden geïntegreerd. Ze maken een snellere en nauwkeurigere analyse mogelijk, vooral bij het verwerken van grote batches. We hebben een efficiënte methode ontwikkeld voor een nauwkeurigere detectie van HA-titers van antigeenvoorraadoplossing, gecombineerd met een rigoureuze back-titratiemethode en een goed gedefinieerd aanpassingsproces.

Deze aanpak biedt een nauwkeurige methode en minimaliseert rekentaken, verhoogt de testefficiëntie en betrouwbaarheid, en draagt bij aan verbeterde ziektebewaking en -bestrijding in pluimveepopulaties. De suspensie van rode bloedcellen bij kippen en de visuele uitlezing van HA HI-resultaten dragen nog steeds bij aan de variabiliteit. Ons lab zal zich richten op het standaardiseren van de RBC-suspensie en het onderzoeken van computervisie of andere methoden om de HA HI-testresultaten te digitaliseren, subjectiviteit te verminderen en de consistentie te verbeteren.

Voeg om te beginnen drie milliliter Alserver-oplossing toe aan een steriele conische centrifugebuis van 15 milliliter. Verzamel een milliliter bloed uit de vleugelader van elk van de drie niet-immuunkippen. Breng vervolgens het verzamelde bloed onmiddellijk over in de antistollingsbuis en meng de inhoud voorzichtig door inversie.

Vul de tube met steriel PBS om het totale volume op 12 milliliter te brengen. Meng de oplossing voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de componenten te garanderen. Plaats de buis vervolgens in een centrifuge die is uitgerust met een horizontale rotor en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 G.

Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het bovenstaande en de witte bloedcellaag uit de buis. Pipetteer met behulp van een pipet een milliliter van de RBC-pellet in 99 milliliter steriele PBS-oplossing om een RBC-suspensie van 1% te bereiden. Om het gevriesdroogde antigeen te reconstitueren, voegt u twee milliliter steriel PBS toe aan de ampul die het bevat.

Schud de ampul voorzichtig om de inhoud volledig op te lossen en laat deze twee tot drie minuten staan om luchtbelvorming te minimaliseren. Aliquot gereconstitueerde oplossing in centrifugebuizen van 1,5 milliliter en bewaar deze in een vriezer die is ingesteld op min 20 graden Celsius tot gebruik. Doseer om te beginnen respectievelijk 40, 80, 120 en 160 microliter PBS in vier aangrenzende putjes van een wegwerpbare 96-well microtiterplaat met V-bodem.

Voeg 20 microliter van het gereconstitueerde antigeen toe aan elk putje en pipetteer 10 keer op en neer om verdunning te creëren. Label vervolgens een nieuwe microtiterplaat duidelijk voor de volgende stappen en doseer 25 microliter PBS in elk putje in rijen één tot vijf. Plaats met behulp van een meerkanaalspipet 25 microliter van de verdunde antigeenoplossingen in de eerste putjes van rij één tot vijf.

Pipetteer de inhoud minstens vijf keer op en neer om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Breng vervolgens 25 microliter over van het eerste putje van elke rij naar het tweede putje en meng grondig. Gooi 25 microliter van de uiteindelijke oplossing weg na de 11e kolom.

Voeg vervolgens respectievelijk 25 microliter PBS en 1% kip RBC-suspensie toe aan elk putje, te beginnen met de putjes met de laagste antigeenconcentratie. Plaats de microtiterplaat op de microplaatschudder om goed te mengen. Laat de plaat ongeveer 30 minuten ongestoord op het werkblad bij kamertemperatuur staan om de rode bloedcellen in de 12e kolom volledig te laten bezinken.

Bereken de verdunningsfactor voor de bereiding van de 4-HAU-antigeenoplossing met behulp van de hier getoonde formule. Bepaal het totale volume van de benodigde 4-HAU-oplossing en de vereiste volumes van de antigeenvoorraadoplossing en PBS met behulp van de gegeven formule. Breng met behulp van een pipet het berekende volume PBS over in een container.

Voeg het overeenkomstige volume antigeenstockoplossing toe en meng grondig om de 4-HAU-antigeenoplossing te bereiden. Doseer vervolgens 25, 50, 75, 100, 125 en 150 microliter PBS in zes aangrenzende putjes van een microtiterplaat. Voeg 25 microliter van de 4-HAU-antigeenoplossing toe aan elk putje en pipetteer 10 keer op en neer om een goede verdunning te garanderen.

Breng met behulp van een meerkanaalspipet 25 microliter van elke verdunde antigeenoplossing van de eerste rij over in de putjes van een andere rij. Voeg vervolgens 25 microliter PBS toe aan elk putje, gevolgd door 25 microliter RBC-suspensie van 1% kip in elk putje. Plaats de plaat ongeveer 20 seconden op een microplate shaker om de inhoud grondig te mengen.

Observeer zorgvuldig de hemagglutinatiepatronen in de putten en noteer de resultaten.