Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

In ons lab richten we ons op het zeldzame type hersentumoren dat diffuse laaggradige gliomen wordt genoemd. Deze gliomen komen vaak voor bij jonge volwassenen en worden gekenmerkt door een mutatie in het gen dat IDH-1 wordt genoemd. De belangrijkste ontwikkelingen op het gebied van gliomen zijn ten eerste het gebruik van 3D-modellen, zoals tumoroïde of organoïde, ten tweede het gebruik van beeldvorming rechtstreeks in de hersenen van muizen die zijn getransplanteerd met gliomen, en ten derde het gebruik van speciaal transcriptomisch en eencellig RNA.

De belangrijkste uitdaging waarmee we worden geconfronteerd wanneer we werken aan IDH-1 mutante gliomen is de lage proliferatie van deze cellen en hun moeilijkheid om in cultuur te worden gehouden, en zodat we een protocol hebben afgeleid en gedefinieerd om de cellen in leven te houden, en voor sommige van hen hebben we een cellijn kunnen afleiden, Maar niet voor alle patiënten. Door IDH-1-mutante cellen in vitro te bestuderen, maar ook in vivo, hebben we ontdekt dat deze cellen vrij plastisch zijn en dat ze het lot van twee cellen kunnen aannemen, ofwel astrocytachtig of ovaalachtig, en we hebben ook ontdekt dat nudge een belangrijke rol speelt in deze plasticiteit. Met dit nieuwe explantatieprotocol zijn we in staat geweest om de IDH-1-mutante cellen wekenlang, maar nog meer, maandenlang, in vitro te houden, en we hebben aangetoond dat er verschillende soorten tumorcellen zijn, zoals we bij patiënten hebben gevonden.

We hebben ook ontdekt dat er enkele tumoromgevingscellen zijn, zoals microgliale cellen, die het mogelijk maken om de interactie tussen tumorcellen en hun omgeving te bestuderen, dus deze modellen bieden een nauwkeurigere weergave van de biologische diversiteit in de tumoren. Bereid om te beginnen de werkruimte voor en rangschik alle gesteriliseerde gereedschappen. Breng de tumorresectie over op ijs om de levensvatbaarheid van het weefsel voor kweek te behouden.

Onderzoek de tumorresectie op grootte en heterogeniteit. Selecteer porties met een grijze kleur met een zachte of geleiachtige textuur, aangezien deze gebieden rijk zijn aan tumorcellen. Breng de geselecteerde tumormonsters over in een microbuis of cryovial van 1,5 milliliter en voeg één milliliter media toe.

Snijd de monsters met een steriele schaar in kleine stukjes van één tot twee kubieke millimeter. Knip vervolgens met een steriele schaar het uiteinde van een pipetpunt van 1.000 microliter af om een brede opening met een diameter van ongeveer drie tot vier millimeter te creëren. Pipetteer 100 tot 200 microliter van de gehakte weefselfragmenten met een afgesneden punt in putjes van een plaat.

Homogeniseer de suspensie voorzichtig opnieuw om een gelijkmatige verdeling te garanderen, aangezien de kleinere fragmenten de neiging hebben snel te bezinken. Plaats de plaat in een broedmachine op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 100% luchtvochtigheid. Vervang de media dagelijks als de metabole activiteit van de tumor snelle vergeling veroorzaakt of als de fragmentdichtheid dit vereist.

Verkrijg om te beginnen de gehakte tumorweefselsuspensie. Voeg voor de bereiding van het vriesmedium twee milliliter DMSO toe aan acht milliliter celkweekmedium. Combineer één volume van de gehakte tumorsuspensie met een gelijk volume van het bereide 20% DMSO-vriesmedium.

Piketdruk het mengsel voorzichtig op en neer om een grondige menging te garanderen. Breng de cryovials snel over in een cryogene container om een geleidelijke temperatuurverlaging mogelijk te maken, en incubeer vervolgens een nacht bij min 80 graden Celsius voordat u ze overbrengt op vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Verwijder voor het ontdooien de cryovials uit vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in een waterbad van 37 graden Celsius.

Verwarm ze tot ongeveer 80% van de cellen is ontdooid. Om de DMSO te verwijderen, brengt u de suspensie snel over in een centrifugebuis van 15 milliliter met vijf milliliter voorverwarmde 1X PBS en centrifugeert u de buis gedurende vijf minuten op 300 G. Verwijder het bovenstaande en herhaal de PBS-wasbeurt, gevolgd door centrifugeren.

Zuig het supernatant op en zorg ervoor dat de pellet ongestoord blijft. Resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid medium en breng deze over in een voorgecoate PDL-laminine 24-wells plaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius.

Cellen met langwerpige, bipolaire of multipolaire morfologieën werden waargenomen die groeiden uit tumorexplantaten die aan het putoppervlak waren bevestigd na een minimale kweekduur van vier weken. Tumor-afgeleide cellen vertoonden een vergelijkbare morfologie tussen verse en cryo-geconserveerde tumoren in drie gevallen, zoals blijkt uit langwerpige en bipolaire verschijningen die ingewikkelde netwerken vormden. Radiale migratie van de tumor-afgeleide cel langs de vezel werd duidelijk waargenomen.

Mislukte explantatieculturen vertoonden niet-aanhangende fragmenten en talrijke gittercellen, gekenmerkt door autofluorescentie en lipidengehalte.