Name: Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer een niet-enzymatische explantmethode voor langdurige cultuur van IDH1-mutante diffuse laaggradige gliomen. Dit protocol behoudt tumorcelkarakteristieken en ondersteunt onderzoek naar celplasticiteit en tumorbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De tumorfragmenten die hier worden gebruikt, maken deel uit van de NEUROLOGY collectie van verse weefselmonsters die worden onderhouden door het Biological Resource Center van het Universitair Ziekenhuis van Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Dit onderzoek werd uitgevoerd onder het project met de titel "Gliomacult: Karakterisering en Primaire Cultuurs van Laaggradige Gliomen," onder leiding van Prof. J. P. Hugnot (Projectnr. RECH/P722/1-5). Dit werk werd ondersteund door La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C wordt ondersteund door de National Council of Humanities Science and Technology (CONAHCYT), Mexico, en de Association for Brain Tumor Research (ARTC), Frankrijk.

De tumorfragmenten die in dit protocol zijn gebruikt, zijn verkregen uit een goed gekarakteriseerde en ethisch goedgekeurde collectie, met toestemming van de patiënt. Dit onderzoek is uitgevoerd onder het project met de titel Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Project nr. RECH/P722/1-5) en is op 28 augustus 2023 goedgekeurd door de wetenschappelijke raad van de tumorbiobank.
1. Voorbereiding van de kweekplaten
OPMERKING: Voer deze stappen uit in een steriele laminaire flowkast voor weefselkweek.
<ol>
	<li>Bereid ten minste 1 u voor aanvang van de cultuur 24-wells platen voor die zijn gecoat met poly-D-lysine (PDL) en laminine.
	<ol>
		<li>Verdun 10 mg PDL-poeder in 100 mL boraatbuffer (pH 8.4) voor een eindconcentratie van 100 µg/mL. Filter de oplossing (0,22 µm) na het oplossen voor steriliteit. PDL is klaar voor gebruik; bereid aliquots van 3 mL en bewaar deze bij -20 °C.</li>
		<li>Ontdooi de buis met 1-2 mg/mL laminine bij 4 °C om gelvorming te voorkomen. Bereid aliquots van 50 µL en bewaar deze bij -20 °C. 
		OPMERKING: Herhaald ontdooien en invriezen dient te worden vermeden.</li>
		<li>Coaten van de platen
		<ol>
			<li>Optionele stap: plaats steriele dekglasjes Ø 13 mm, geschikt voor celkweekschalen, in een 24-wells plaat, één dekglasje per well. 
			OPMERKING: Deze stap is bedoeld voor verdere immunokleuring van glioom-explantaten.</li>
			<li>Meng voor het coaten van de wells 3 mL van de PDL-oplossing met 9 mL 1x PBS en voeg 50 µL laminine toe. Voeg 500 µL van deze oplossing toe aan elke well voor een coatingconcentratie van 1-2 µg/cm². Incubeer de gecoate platen bij kamertemperatuur, bij voorkeur met langzaam schudden (15 RPM), gedurende ten minste 1 u.</li>
			<li>Verwijder direct voor de cultuur de PDL-laminine-oplossing en spoel twee keer met steriele 1x PBS. 
			OPMERKING: Laat de wells niet uitdrogen.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Media
<ol>
	<li>Kweek IDH1-mutante explantaten in een gedefinieerd medium bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met L-glutamine, samen met een serumvervangend mengsel bestaande uit N2 en B27 zonder vitamine A. Gebruik antibiotica, waaronder ciprofloxacine, gentamicine en fungin, om bacteriële en schimmelcontaminatie te voorkomen. Voeg daarnaast de groeifactoren heparine, EGF en FGF2 toe aan het medium, filter dit (0,2 µm) en bewaar het tot 2 weken bij 4 °C. 
	OPMERKING: Raadpleeg voor details over de ingrediënten en de bereiding van de media Tabel 1 en de Tabel met Materialen.</li>
</ol>
3. Voorbereiding van het explantaat
<ol>
	<li>Bereid vóór de monsterverwerking de werkruimte en de steriele instrumenten voor zoals afgebeeld in Figuur 1A. Desinfecteer een koelelement door het te besproeien met 70% ethanol. Steriliseer de schaar en de pincet door ze onder te dompelen in 70% ethanol en daarna spoelen met PBS.</li>
	<li>Breng de tumorresectie direct op ijs over voor kweek, idealiter binnen 2 u na de chirurgische extractie (Figuur 1B). 
	OPMERKING: Het tumormonster moet een minimale diameter van 9-10 mm hebben om betere resultaten te garanderen. Het weefsel wordt getransporteerd zonder kweekmedium, aangezien deze methode geprefereerd wordt voor histologische doeleinden. De afwezigheid van vloeistof voorkomt de vorming van ijskristallen tijdens het flash-freezen, waardoor de weefselintegriteit behouden blijft voor eventueel subsequent histologisch onderzoek.</li>
	<li>Plaats de kweekschaal met het tumorspecimen op het koelelement en spoel het voorzichtig met 1X PBS om overtollig bloed te verwijderen.</li>
	<li>De geresecteerde tumor vertoont vaak aanzienlijke omvang en heterogeniteit, bestaande uit tumormassa, geïnfiltreerd weefsel en niet-tumorale componenten (Figuur 1C). Selecteer delen met een grijze kleur en een zachte of gelei-achtige textuur voor de isolatie van tumorcellen, aangezien deze doorgaans meer tumorcellen bevatten. Vermijd daarentegen harde en witte regio's, omdat deze mogelijk minder tumorcellen bevatten die geschikt zijn voor kweek (Figuur 1D), evenals zwartgeblakerde gebieden, aangezien deze waarschijnlijk het gevolg zijn van elektrocauterisatie en mogelijk geen betrouwbare analyseresultaten opleveren.</li>
	<li>Breng de geselecteerde monsters over naar een 1,5 mL microbuisje of cryovial om ze fijn te hakken. Voeg 1 mL steriel medium toe aan het 1,5 mL microbuisje of de cryovial en hak het monster met de steriele schaar tot er kleine stukjes (1-2 mm3) zijn verkregen. 
	OPMERKING: Ongeveer 1-2 min hakken is nodig om minuscule fragmenten te verkrijgen, doorgaans 1-2 mm3 in grootte (Figuur 1E).</li>
	<li>Trim met een steriele schaar voorzichtig het uiteinde van een blauwe 1.000 µL pipetpunt om een brede opening te creëren, ongeveer 3-4 mm in diameter. Pipetteer met deze aangepaste punt 50-200 µL van de fijngehakte weefselfragmenten en verdeel deze gelijkmatig over elke well. Omdat de kleinere stukjes de neiging hebben om snel te bezinken, moet de suspensie in elke well voorzichtig opnieuw worden gehomogeniseerd om een uniforme verdeling te garanderen. 
	​OPMERKING: Voorkom overbevolking en houd een balans door geen excessief aantal fragmenten in elke well te introduceren (Figuur 1F).</li>
	<li>Incubeer de tumorfragmenten bij 37°C in een 5% CO2-incubator met 100% vochtigheid. Verschoon het medium dagelijks indien de metabole activiteit van de tumor (aangegeven door een snelle vergeling van het medium) en het aantal fragmenten in elke well dit vereisen. Wees voorzichtig tijdens het verschoonen van het medium door het medium behoedzaam af te zuigen met een pipet uitgerust met een 200 µL punt, waarbij u ervoor zorgt dat aanhechtende tumorfragmenten niet worden verstoord.</li>
</ol>
<img alt="Proces van tumorweefselpreparatie; opstelling van apparatuur; weefselmonsters; centrifugeresultaten; analysegrafiek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Procedure voor tumor-explantcultuur. Een resectie van een diffuus laaggradig glioom werd verkregen van een 44-jarige patiënt met de diagnose graad II astrocytoom volgens de WHO 2021-classificatie. De tumor vertoonde een IDH1-mutatie (Exon 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) en een TP53-mutatie (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), samen met de afwezigheid van ATRX-kleuring. Er werden geen mutaties gedetecteerd in de Ets/TCF-bindingssites (C250T en C228T) van het TERT-gen. (A) Het werkoppervlak bestaat uit een koelelement, wat een omgeving biedt die degradatie van het monster minimaliseert en de levensvatbaarheid van biologische componenten behoudt. Deze voorzorgsmaatregelen zijn belangrijk voor het behoud van de kwaliteit en integriteit van het weefsel. (B) Transport van het monster van het ziekenhuis naar het laboratorium dient op ijs te geschieden. (C) Fragment van de tumorresectie. De pijlen tonen de meest geschikte delen voor cultuur. (D) Dissectie van de tumor wordt uitgevoerd om het meest relevante deel te selecteren dat fijngehakt moet worden. Naar onze ervaring is de kans kleiner dat witte stof succesvolle explanten oplevert. (E) Tumorfragmenten van ongeveer 1-2 mm³ diameter in een 15 mL buis na mechanisch fijnmalen met een schaar. (F) Het aantal tumorstukjes dat nodig is voor de juiste uitzaaiing wordt getoond voor wells op een 24-well plaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Cryopreservatie en ontdooien van fijngehakte tumor
OPMERKING: Cryopreservatie waarborgt een reserve in geval van contaminatie en verlies van explantaatkweken of om de tumorstalen op een later tijdstip te verwerken.
<ol>
	<li>Cryopreservatie: Bereid het vriesmedium (20% v/v DMSO-oplossing) voor door 2 mL DMSO toe te voegen aan 8 mL celkweekmedium.</li>
	<li>Meng 1 volume van de suspensie van het fijngehakte tumorweefsel met een gelijk volume van het 20% DMSO-vriesmedium om een uiteindelijke concentratie van 10% DMSO te verkrijgen. Pipetteer het mengsel voorzichtig op en neer om een grondige menging te waarborgen en verdeel vervolgens ongeveer 1 mL over cryovials.</li>
	<li>Plaats de cryovials snel in een cryogene container voor een geleidelijke temperatuurverlaging, gevolgd door een incubatie gedurende de nacht bij -80 °C vóór definitieve bewaring in vloeibare stikstof. 
	OPMERKING: Deze stap moet onmiddellijk worden uitgevoerd nadat de cellen in het vriesmedium zijn geplaatst, aangezien bepaalde cryoprotectanten, zoals DMSO, schadelijk kunnen zijn als de cellen hieraan worden blootgesteld bij kamertemperatuur langer dan noodzakelijk.</li>
	<li>Ontdooien: Haal de cryovials uit de vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C totdat ongeveer 80% van de cellen is ontdooid.</li>
	<li>Om de DMSO te verwijderen, pipetteert u de suspensie snel in een 15 mL centrifugebuis die 5 mL voorverwarmde 1x PBS bevat en centrifugeert u bij 300 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en herhaal de wasstap met 1X PBS, gevolgd door centrifugatie (stap 4.5). Aspireer het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt de pellet niet te verstoren, en voeg de juiste hoeveelheid medium toe om over te brengen naar een vooraf gecoate PDL-Laminin 24-wells plaat en plaats deze in de incubator.</li>
	<li>Verifieer na 24 u dat de cellen zijn gehecht. Verwijder na enkele dagen de niet-adherente fragmenten door het kweekmedium te vervangen.</li>
</ol>
5. Passageren van de cultuur
OPMERKING: Zodra ze zijn gevestigd, kunnen explantaten worden gebruikt voor videomicroscopie of immunokleuring. Als alternatief, indien tumorcellen uit het explantaat zijn gemigreerd en gezond lijken, kan het explantaat worden gepassaged via enzymatische dissociatie en opnieuw worden gezaaid in wells voor verdere experimenten. Het is echter belangrijk op te merken dat dit protocol niet is ontworpen voor herhaald passageren. Meestal kan slechts één passage worden geprobeerd voordat de tumorcellen senescent worden of afsterven. Niet alle explantaatkweken zullen leiden tot een succesvolle passage.
<ol>
	<li>Om de cellen te passeren, wordt het oude medium verwijderd, wordt er gespoeld met 1X PBS en worden (125 µL) 0,05% trypsine-EDTA aan de wells toegevoegd; incubeer dit gedurende 3-4 min bij 37 °C, gevolgd door de toevoeging van 6,5 µL trypsine-inhibitor, 12 µL 20 mM CaCl2 (eindverdunning tot 2mM) en 1 µL DNAse I. 
	OPMERKING: De benodigde incubatietijd voor dissociatie kan variëren afhankelijk van de cultuur. Het is belangrijk om na ten minste 3 min te controleren of de cellen zijn losgekomen. Meestal wordt het explantaat niet volledig gedissocieerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen en blijven er vaak kleine clusters over, die nieuwe explantaatculturen kunnen genereren.</li>
	<li>Spoel met een p1000 ingesteld op 500-600 µL voorzichtig om de explantaten te desaggregeren. Vermijd beluchting.</li>
	<li>Voeg 5 mL 1x PBS toe en centrifugeer 5 min bij 300 × g. Aspireer het supernatant, resuspendeer het pellet in vers voorverwarmd medium en tel de cellen voor het uitplaten.</li>
	<li>Identificeer culturen met het potentieel om cellijnen te genereren door delende cellen te observeren onder een fasecontrastmicroscoop. Deze delende cellen hebben doorgaans een afgeronde morfologie en zichtbare chromosomen, zoals weergegeven in Figuur 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+low-grade+glioma+-+changing+concepts+in+diagnosis+and+management%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review.</a> Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).</li>
<li>Louis, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of malignant gliomas.</a> Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).</li>
<li>Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiotherapy+on+diffuse+low-grade+gliomas+evolution%3A+Confronting+theory+with+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data.</a> J Pers Med. 11 (8), 818(2021).</li>
<li>Pirozzi, C. J., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+idh+mutations+for+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The implications of idh mutations for cancer development and therapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).</li>
<li>Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+infiltrating+oligodendroglioma+and+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma.</a> J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).</li>
<li>Suva, M. L., Tirosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glioma+stem+cell+model+in+the+era+of+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics.</a> Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).</li>
<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Het ontwikkelen van in vitro- en preklinische modellen voor IDH1-gemuteerde laaggradige gliomen is bijzonder uitdagend vanwege de langzame groei van deze tumoren en de complexiteit van het repliceren van de uitgebreide genomische en epigenomische veranderingen die door de IDH-mutatie worden veroorzaakt. Bovendien interageren deze infiltratieve tumorcellen actief met omringende cellen, waaronder immuun-, endotheel-, glia- en neuronen, waarbij ze mogelijk afhankelijk zijn van deze cellen voor hun overleving. Deze complexe ...

Diffuse gliomen zijn de meest voorkomende primaire hersentumoren. Deze tumoren zijn momenteel ongeneeslijk ondanks zeer intensieve behandeling (chirurgie, radio- en chemotherapie)1. Toenemend bewijs ondersteunt de hypothese dat gliomagenese ontstaat uit volwassen stam- of gliale voorlopercellen die in de hersenen aanwezig zijn2. Hoewel glioblastoma's het meest agressieve type vertegenwoordigen, zijn diffuse laaggradige gliomen (DLGG, graad 2 tumoren) ook prevalent (15% van diffuse gliomen)1,3. DLGG's groeien langzaam en migreren langs witte stofbanen, een kenmerk van deze 'diffuse' neoplasma4. Deze DLGG komen zeer vaak terug ondanks behandeling, uiteindelijk progresserend tot hooggradige maligniteiten (graden 3 en 4)5.
DLGG's worden gekenmerkt door een missense-mutatie in het isocitraatdehydrogenase 1 of 2-gen (IDH1 of IDH2), resulterend in de abnormale productie van de oncometabolite 2-hydroxyglutaraat (2HG). Dit verstoort celdifferentiatie door epigenetische dysregulaties6. IDH1-mutante gliomen worden verder ingedeeld in subtypes: astrocytomen hebben typisch mutaties in ATRX en P53, terwijl oligodendrogliomen worden gekenmerkt door 1p19q-deleties7. Deze tumoren vertonen een heterogeniteit van tumorcellen. Single-cell RNA-sequencing en immunokarakterisering hebben een diverse populatie tumorcellen onthuld, die stamcel-achtige, astrocyt-achtige en oligodendrocyte-achtige fenotipen vertonen binnen deze tumoren8,9.
In tegenstelling tot glioblastoom, dat profiteert van direct beschikbare, langetermijncultures en cellijnen, bestaat er een opmerkelijke schaarste aan cellulaire tools die zijn aangepast voor het onderzoeken van IDH1-mutante tumoren1. Dit vormt een aanzienlijk obstakel voor het bevorderen van therapeutische ontwikkeling en het verdiepen van ons begrip van IDH1-mutante gliomagenese en ziekteprogressie. Traditionele, in serum gekweekte cellijnen, hoewel lang gebruikt, repliceren de originele tumoren onvoldoende en vertonen gewijzigde transcriptieprofielen. Alternatief, serumvrije kweekomstandigheden, hetzij in 2D of 3D tumoroïde modellen, behouden effectiever de transcriptieprofielen van tumorcellen en hun in vivo-fenotypen, zoals invasie in normaal hersenweefsel10,11.
Daarnaast behouden kortetermijncellencultures, afgeleid van een patiënts chirurgisch specimen, het moleculaire profiel en de cellulaire diversiteit van de tumor, waardoor ze de biologische eigenschappen van tumoren beter vertegenwoordigen in vergelijking met cellijnen12. Hierin introduceren we een eenvoudige niet-enzymatische methode voor het kweken van IDH1-mutante diffuse laaggradige gliomen, gekweekt als explantaten afgeleid van verse of bevroren patiëntresecties, met als doel te voldoen aan de behoefte aan verbeterde in vitro-modellen voor glioomonderzoek en therapeutische ontwikkeling. Ze bieden ook het potentieel om IDH1-mutante cellijnen te ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556604</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA001906</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Fujifilm Wako Antibodies</td><td>019-19741</td><td>Verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-IDH1 (R132H) mouse Monoclonal Antibody</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556003</td><td>Verdunning 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R&amp;D Systems&reg;</td><td>AF2417</td><td>Verdunning 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Verdunning 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Cell Freezing Container, voor 12 x 1 mL of 2 mL Cryogenic Vials</td></tr><tr><td>Cover slip &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Assistent&trade;</td><td>328017</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, zonder glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;s Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td><td>Corning&reg;</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom</td><td>Corning&reg;</td><td>353047</td><td>TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, met Deksel, Sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x )</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Serum acrodisc 37 mm spuitfilter met GF/0.2 &micro;m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>straight widefield epifluorescentiemicroscoop</td></tr></tbody></table>

een protocol voor explantaatculturen van idh1-mutant diffuse laaggradige gliomen

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

Diffuse glioma's, de meest voorkomende primaire hersentumoren, worden ingedeeld in laag- en hooggradige tumoren op basis van histopathologische criteria en genetische mutaties. Diffuse laaggradige glioma's vormen een subgroep, die voornamelijk jonge volwassenen treft en vatbaarheid voor hooggradige glioma's veroorzaken. Er zijn twee hoofdtypen diffuse laaggradige glioma's: astrocytomen en oligodendrogliomen, elk gedefinieerd door specifieke genetische en histologische kenmerken. Deze tumoren vertonen kenmerkend een gemuteerde variant van het metabolische enzym IDH1, wat cellulaire differentiatie verstoort. Ze zijn heterogeen en bevatten zowel proliferatieve stamcellen als meer gedifferentieerde, rustige gliacellen.
Patintspecifieke, in vitro tumormodellen hebben een groot potentieel voor het ontrafelen van oncogeen mechanismen en het afstemmen van geneesmiddelkeuze voor gepersonaliseerde therapie. Echter, het ontbreken van betrouwbare in vitro modellen specifiek voor IDH1-mutante laaggradige glioma's heeft fundamenteel en translationeel onderzoek belemmerd. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het kweken van IDH1-mutante tumoren als explantaten in gedefinieerde media zonder enzymatische dissociatie nodig te hebben. Deze explantaten kunnen langere perioden worden gehandhaafd, waarbij de expressie van IDH1-mutante eiwitten evenals markers voor oligodendrocyte voorlopercellen zoals ASCL1 (MASH1), OLIG1, en OLIG2 en voor astrocyten (GFAP, SOX9) behouden blijft. Ze kunnen ook worden gevestigd vanuit bevroren tumoren in DMSO. Deze culturen kunnen dienen als een waardevolle platform voor geneesmiddelscreening, videomicroscopie en genstudies, waardoor vooruitgang in het begrijpen en behandelen van deze uitdagende tumoren wordt vergemakkelijkt. Ze bieden ook de mogelijkheid om IDH1-mutante cellijnen af te leiden.

Na enkele dagen zullen sommige tumorfragmenten aan de wanden van de well hechten, wat de uitgroei van cellen uit de explantaten initieert. De tijd tussen het initiële uitplaten en het verschijnen van groeiende tumorcellen verschilt per monster. De initiële culturen bevatten vaak aanzienlijk cellulair debris, waardoor het moeilijk is om de aanwezigheid van levensvatbare cellen vast te stellen. Bijgevolg moet de cultuur gedurende minimaal 4 weken worden onderhouden. Zodra de cellen beginnen te groeien, worden langwerpige c...

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

a-protocol-for-explant-cultures-idh1-mutant-diffuse-low-grade

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the process of isolating and culturing glial progenitor cells from diffuse intrinsic pontine glioma, or DIPG-affected brainstem tissue. Glial cells isolated from tumor tissue via an enzymatic digestion are cultured in a neurobasal medium, which promotes their growth and the development of free-floating neurospheres.

Isolating and Culturing Cells from Diffuse Intrinsic Pontine Glioma

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle verwerking van post-mortem diffuse intrinsieke pontijnse glioom monsters voor de oprichting van de patiënt afgeleide celcultuur modellen of directe karakterisering van tumor en micro-omgeving van de cellen.

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Hier beschrijven we een methode om glioblastoom (GBM) organoïden te genereren uit primaire patiëntspecimens of van patiënten afgeleide celculturen en deze tot volwassenheid te houden. Deze GBM-organoïden bevatten fenotypisch diverse celpopulaties en recreëren tumormicro-omgevingen ex vivo.

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

Leer een niet-enzymatische explantmethode voor langdurige cultuur van IDH1-mutante diffuse laaggradige gliomen. Dit protocol behoudt tumorcelkarakteristieken en ondersteunt onderzoek naar celplasticiteit en tumorbiologie.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

Meer video's verkennen